Geschichte
Das Klonen von Rindern begann in unserem Labor 1986 mit der Einführung von Spenderzellen im embryonalen Spaltstadium in enukleierte Metaphase-II-Eizellen, was zur Trächtigkeit und Geburt von zwei gesunden Kälbern führte (Prather et al., 1987). Unser Erfolg und der fast zeitgleiche Erfolg bei Granada Genetics wurden durch mehrere Faktoren ermöglicht. Studien an Amphibien zeigten, dass eine fortgeschrittenere Entwicklung durch den Transfer von Kernen in enukleierte Metaphase-Oozyten anstelle von enukleierten pronukleären Zygoten auftrat (Hoffner und DiBerardino, 1980). Untersuchungen an Mäusen zeigten, dass die Häufigkeit der Entwicklung nach dem Kerntransfer (NT) viel höher war, wenn die Kerne in Mäuseozyten fusioniert statt mikroinjiziert wurden (McGrath und Solter, 1983). Die Studien von Willadsen (1986) an Schafen zeigten, dass Lämmer durch Elektrofusion von embryonalen Stammzellen in enukleierte Metaphase-II-Oozyten erzeugt werden konnten. Das Aufkommen von Methoden zur Herstellung von Embryonen in vitro und zur Kultivierung von Embryonen bis zum Blastozystenstadium erleichterte auch das Aufkommen des Klonens von Rindern, da Rinderembryonen üblicherweise im Blastozystenstadium in Kühe übertragen wurden, um Nachkommen zu erzeugen (First, 1990; Gordon, 1994; Fulka et al, 1998).
In diesen frühen Studien wurden embryonale Stammzellen aus dem Cleavage-Stadium bis zum Morula-Stadium für den Transfer in enukleierte Metaphasen-Oozyten verwendet, da die frühe Amphibien-Literatur nahelegte, dass embryonale Stammzellen totipotent sind, somatische oder fötale differenzierte Zellen jedoch nicht (DiBerardino, 1988; DiBerardino, 1997). Dies wurde bei Säugetieren durch Studien wie die von Navara et al. (1994) bestätigt. In dieser Studie wurden polarisierte und an die Trophoblastenlinie gebundene Zellen als Kernspender verwendet und führten zu sehr wenigen Embryonen im Blastozystenstadium (7%; n=158), während nicht polarisierte und nicht differenzierte Zellen als Kernspender eine hohe Frequenz von Blastozysten ergaben (47%; n=184). Im Vergleich dazu entwickelten sich 30% von 139 unselektierten Embryonen bis zum Blastozystenstadium. Die Schlussfolgerung in den 1980er Jahren, dass nur undifferenzierte Zelltypen als Kernspender entwicklungswirksam waren, war auf die große technische Einschränkung zurückzuführen, dass künstliche Methoden nicht in der Lage waren, Eizellen so schnell und effektiv zu aktivieren wie Spermien (Ware et al., 1989). Dies zwang zur Verwendung von gealterten Oozyten, die die Fähigkeit zur Umprogrammierung eines differenzierten Zellkerns verloren hatten. Ein Vergleich von jungen und gealterten Oozyten ist in Tabelle 20.1 aus dem Labor von First dargestellt. Tatsächlich wurde bei vielen frühen Protokollen der beste Erfolg erzielt, wenn die Oozyte so gealtert war, dass die Kernhülle der Spenderzelle und ihr Inhalt in toto erhalten blieben, ohne dass es zu einem Kernhüllenzusammenbruch kam (Saeki et al., 1991; Leibfried-Rutledge et al., 1992; Poccia und Collas, 1997). Oozyten, die mäßig gealtert waren, ließen den Zusammenbruch der Kernhülle zu, bauten aber die Kernhülle schnell wieder auf und entfernten einen Teil des Chromatins aus dem Kern.
Tabelle 20.1. Verwendung von jungen versus gealterten Eizellen beim Kerntransfer
| Prozess | 24 Stunden | 48 Stunden |
|---|---|---|
| Künstliche Aktivierung | Schlecht | Exzellent |
| Nuklearer Hüllenzusammenbruch und Wiederaufbau | Ja | Nein |
| Synchronität von Zellkern und Eizelle | Essentiell | Nicht essentiell |
| Zell- und genomische Reprogrammierung der Spenderzelle | Ja | Nein |
| Reihenfolge und Zeitpunkt der Aktivierung | Kritisch | Nicht kritisch |
| Erfolgreiche Spenderzellen | Differenzierte adulte oder fetale | Totipotente embryonale |
Die Fähigkeit, junge bovine Eizellen zu aktivieren, kam durch die Entwicklung von Verfahren zustande, die die Aktivität von Metaphase-promoting factor (MPF) und cytostatic factor (CSF) unterdrücken, im Vergleich zu Ca2+ -Ionophoren (Liu und Yang, 1999). MPF wird über die H1-Kinase-Aktivität und CSF über die Aktivität der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) gemessen; zusammen halten sie Metaphasen-Oozyten im meiotischen Arrest. Diese Fähigkeit, junge Oozyten zu aktivieren, lieferte die Grundlage für die Nutzung der Fähigkeit von Metaphase-II-Oozyten, fetale oder somatische Kernspenderzellen in NT zu reprogrammieren. Ein solches Verfahren ist die Aktivierung junger Metaphase-II-Oozyten mit einem Calcium-Ionophor, gefolgt von einer 4- bis 6-stündigen Exposition mit 6-Dimethylaminopurin (6-DMAP), um die Phosphorylierung von Serin- und Threoninresten an MPF und MAPK zu stören (Susko-Parrish et al., 1994). Eine andere Methode verwendet Butyrolacton für den gleichen Zweck (Motlik et al., 1998; Motlik et al., 2002). Eine Studie über den Zusammenhang von MPF, MAPK und der Kernprogressionsdynamik während der Aktivierung von jungen und gealterten Rinderozyten legte nahe, dass die Inaktivierung von MPF und MAPK Voraussetzung für die Befreiung aus dem Metaphasenarrest und die Bildung von Vorkernen in Rinderozyten ist (Tian et al., 2003). Jang et al. (2005) verglichen die Entwicklungskompetenz von somatischen Zellkerntransfer (SCNT)-Embryonen, die mit verschiedenen Spenderzellen rekonstruiert wurden, und analysierten die Genexpression im resultierenden Embryo.
Die Aktivierung kann auch durch Hemmung der Proteinsynthese mit Cycloheximid (CHX) nach einer Ionophor-Behandlung erreicht werden, gefolgt von einer Inkubation mit Cytochalasin B (CB), um die Chromatinextrusion aus der Zelle zu verhindern und dadurch einen diploiden Zustand zu erhalten (Liu und Yang, 1999). Bhak et al. (2006) untersuchten die Entwicklungsrate und Ploidie von Embryonen, die durch NT mit verschiedenen Aktivierungsbehandlungen bei Rindern erzeugt wurden. In dieser Studie wurden drei Methoden zur Oozytenaktivierung, nämlich Ionomycin allein, Ionomycin+DMAP und Ionomycin und CHX für die Entwicklung von durch SCNT erzeugten Embryonen zu Parthenoten und IVF-Pendants verglichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DMAP-Behandlung nach Ionomycin die Entwicklungsraten der Parthenoten stark erhöht, aber keinen Unterschied in der Blastozystenentwicklung im Vergleich zur CHX-Behandlung zeigte. Allerdings erhöhte die DMAP-Behandlung die zeitabhängige Abspaltungsrate zu Embryonen im Zweizellstadium. Außerdem erhöhte sie die Inzidenz von Chromosomenanomalien in Parthenoten und SCNT-Embryonen stark. Bhak et al. (2006) kamen zu dem Schluss, dass CHX in Kombination mit Ionomycin für die Oozytenaktivierung während der NT bei Rindern besser geeignet ist als DMAP. Dehydroleucodin (DhL) wurde als chemischer Aktivator von Rinderozyten und SCNT-rekonstituierten Embryonen evaluiert (Bhak et al., 2006). In jüngerer Zeit wurde DhL als chemischer Aktivator von Rinderozyten und SCNT-rekonstituierten Embryonen evaluiert (Canel et al., 2010). Oozyten wurden mit niedrigen und hohen Dosen von Ionomycin aktiviert und mit niedrigen und hohen Dosen von DhL allein oder abwechselnd mit CB exponiert. Die Ergebnisse zeigten, dass DhL eine Pronukleusbildungsdynamik induziert, die IVF-produzierten Embryonen ähnlicher war als DMAP und dass niedrige DhL-Dosen die Blastozystenentwicklung erleichtern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein niedriger DhL1-Spiegel in Kombination mit einer langen Exposition gegenüber dem CB-Protokoll für SCNT-Programme nützlich sein könnte (Canel et al, 2010).
Die Blastozystenentwicklung nach In-vitro-Fertilisation oder NT wurde durch die Entdeckung gefördert, dass die ersten Oozyten, die ca. 16 h nach der Follikelentnahme die Metaphase II erreichen, wenn sie 8 h später inseminiert werden, eine viel höhere Frequenz von Blastozysten produzieren als Embryonen, die aus Oozyten gewonnen werden, die nach 24 h reif sind (Dominko und First, 1997). Die Fähigkeit, hochkompetente junge Oozyten zu produzieren, die früh aktiviert werden konnten, ermöglichte es uns, Blastozysten, Schwangerschaften und Nachkommen aus der inneren Zellmasse von Blastozysten zu erzeugen, die vier bis sechs Passagen lang kultiviert, vermehrt und passagiert worden waren (First et al., 1994; Sims und First, 1994). Die Effizienz war nicht hoch; etwa 15 % der NTs produzierten Blastozysten und vier Kälber resultierten aus 34 Embryotransfers. Die DNA-Typisierung dieser Kälber bestätigte, dass ihre Identität mit den Zelllinien übereinstimmte, aus denen sie stammten (First et al., 1994). Die Effizienz der NT war höher, wenn Blastomere im Spaltstadium oder Morulazellen im Modell der gealterten Eizelle verwendet wurden. In jüngerer Zeit zeigten Kwun et al. (2003), dass sich in vitro kultivierte oder NT-produzierte Embryonen in Gegenwart einer Kombination aus Fruktose und Glukose mit einer höheren Rate zum normalen Blastozystenstadium entwickelten. Diese Gruppe kam zu dem Schluss, dass Fruktose ein effizienteres Energiesubstrat als Glukose sein könnte, um eine große Anzahl von übertragbaren Blastozysten aus SCNT zu produzieren (Kwun et al., 2003). Eine Alternative zur Fusion des Zellkerns in eine enukleierte Eizelle statt durch Mikronadel oder Elektrofusion ist die Verwendung von inaktivierten fusogenen Viren zum Einbringen des Zellkerns in die enukleierte Eizelle, wie sie von Rodríguez et al. (2008) vorgestellt und rezensiert wurde. Bei dieser Methode wird eine Halbschale einer enukleierten Oozyte mit einem Spenderkern versehen und eine weitere Oozytenhälfte darüber verschmolzen. Dies führte dazu, dass 65,7 % der Eizellen zu Blastozysten wurden, wenn der Kern aus einer adulten somatischen Zelle stammte und 38,2 %, wenn der Spenderkern aus einer fetalen Zelle stammte (Rodríguez et al, (Rodríguez et al., 2008).
Bei der Verwendung von embryonalen Zellen als Spender haben 20-50 % der Kerntransfers zu Blastozysten für den Transfer in Kühe geführt, von denen etwa 50 % zu Schwangerschaften führen.
Bis 1993 wurden Hunderte von Kälbern aus NT mit embryonalen Zellen als Kernspender erzeugt. Bis heute ist diese Zahl gewachsen, aber nicht exponentiell, wie man erwarten würde. Eine erfolgreiche NT erfordert die vollständige Löschung des genomischen Imprintings und des Methylierungsstatus sowie eine perfekte Reprogrammierung des Genoms der Spenderzelle. Das reprogrammierte Genom muss seine Stabilität während der gesamten Entwicklung beibehalten und schließlich zu einem lebensfähigen Nachkommen mit normal differenzierten Organen führen. Die Reklonierung wurde bereits durchgeführt, und es wurden sowohl gefrorene Spenderzellen, ohne Kryoprotektor eingefrorene Organe als auch in vitro gereifte Eizellen verwendet (Stice und Keefer, 1993; Barnes et al., 1993). Bestenfalls 20-50% der NTs haben zu Blastozysten für den Transfer in Kühe geführt, von denen etwa 50% zu Trächtigkeiten führen. Die Trächtigkeitsverluste sind jedoch höher als normal, wobei bis zu 20 % der Trächtigkeiten nicht zur Welt kommen und eine Geburtseinleitung erforderlich ist, wobei die Kälber oft größer als normal sind (Rodriguez-Osorio et al., 2009, 2012; Oback und Wells, 2007; Cibelli, 2007; Niemann et al., 2008; Kato et al., 1998; Oback 2009).
Kommerzielle Unternehmen haben versucht, die Effizienz des embryonalen Klonens auf ein Niveau und zu Kosten zu verbessern, die für die kommerzielle Rinderproduktion geeignet sind. Leider ist ein ausreichendes Effizienzniveau noch nicht erreicht worden. Bei Milchkühen erforderte die Produktion von embryonalen Klonen von hochmilchproduzierenden Rindern die Aufzucht bis zur Milchproduktion und dann die Selektion von hochmilchproduzierenden embryonalen Klonlinien. Das kommerzielle Interesse am embryonalen Klonen verschwand mit dem Aufkommen des Klonens aus primordialen Keimzellen und fetalen oder adulten somatischen Zelllinien. Es gibt immer noch Versuche, bovine embryonale Stammzellen in einer Anzahl zu kultivieren, die groß genug für den Gentransfer und die Selektion von transgenen Kolonien vor NT ist (Mitalipova et al., 2001; Merton et al., 2003; Rodriguez-Martinez 2012). In jüngster Zeit wurden induzierte pluripotente Stammzellen bei gentechnisch veränderten Rindern und bei transgenen Zuchtanwendungen eingesetzt (Cao et al., 2012; Han et al., 2011; Dong et al., 2007).