Diese Studie basiert auf einem Membransystem, das K. R. Porter am Herzen lag: dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) der quergestreiften Muskelfasern. Porter taufte das reichhaltige Membransystem, das die Myofibrillen in allen Muskelzellen eng und vollständig umgibt, aufgrund seiner Lage (sarkoplasmatisch) und seiner Gesamtstruktur als ausgedehntes Netzwerk (Retikulum) treffend auf den Namen SR. In seinen Beschreibungen des SR, die in Zusammenarbeit mit H. S. Bennett (1-3) entstanden, erkannte Porter zwei wichtige Aspekte dieses Membransystems. Der erste ist, dass das SR einfach eine spezialisierte Ausprägung des endoplasmatischen Retikulums (ER) ist, das alle Zelltypen durchdringt, und der zweite ist, dass die genaue Anordnung des SR in Relation zu den Myofibrillen auf seine Rolle in einem Aspekt der Kontrolle der Kontraktilität hinweist. Beide Erkenntnisse von Porter sind nun vollständig bestätigt. Es ist bekannt, dass sich das SR zunächst als ER entwickelt, das die üblichen generischen ER-Proteine enthält, und dass es bei der Differenzierung der Muskelzelle stark mit SR-spezifischen Proteinen angereichert wird (4, 5). Drei Proteine, die zuerst aus dem SR gereinigt wurden, sind die Kalzium-ATPase oder das Kalzium-Pumpen-Protein, das für das Pumpen von Kalzium in das Lumen des SR während der Entspannung verantwortlich ist (6); Calsequestrin, das Kalzium-bindende Protein mit niedriger Affinität, das die Kapazität des SR-Lumens für Kalzium stark erhöht (7); und der Ryanodin-Rezeptor (RyR), der für die Kalzium-Freisetzung während der Muskelaktivierung verantwortlich ist (siehe ref 8 für eine Übersicht). Später wurde festgestellt, dass alle Zelltypen zellspezifische Formen und/oder Analoga dieser drei Proteine enthalten, die für den Umgang mit Kalzium verantwortlich sind. In allen Zellen neigen diese Proteine dazu, in Gruppen zusammengefasst zu werden. Das SR ist also eine umfangreiche, spezialisierte Domäne des Muskelzell-ER. Umgekehrt enthalten alle Zellen SR-ähnliche spezialisierte Domänen, aber in viel kleineren Mengen. Einige Nicht-Muskelzellen, wie die Purkinje-Zellen des Kleinhirns, haben tatsächlich ausgedehnte SR-ähnliche Domänen, die muskelspezifische Isoformen von RyRs und Calsequestrin enthalten (9, 10).
Wie Porter in seinem unnachahmlichen Stil schrieb: „Die präzise morphologische Beziehung des Retikulums zu den Myofibrillen…. legt die Vermutung nahe, dass das System bei der Muskelkontraktion funktionell wichtig ist.“ Das Verständnis der spezifischen Rolle des SR bei der Kontrolle der Muskelkontraktion wurde durch kritische Veröffentlichungen in der spannenden Periode geprägt, die Porters Beschreibungen des SR unmittelbar vorausging und folgte. Die lokalen Stimulationsexperimente von A. F. Huxley, die in den späten 50er und frühen 60er Jahren durchgeführt wurden, wiesen auf das Vorhandensein eines spezifischen Weges hin, der die Ausbreitung des elektrischen Ereignisses in das Faserinnere ermöglichte und somit eine entscheidende Verbindung zwischen der Oberflächendepolarisation und der schnellen Aktivierung der zentral gelegenen Myofibrillen lieferte (siehe Ref. 11 für eine Übersicht). Die bahnbrechende Arbeit von A. Weber aus dem Jahr 1959 lieferte den ersten Beweis dafür, dass Kalziumionen, die nun vollständig als allgemeine intrazelluläre Botenstoffe anerkannt sind, für die Kontrolle der Muskelkontraktion verantwortlich sind (12). S. Ebashi und A. Weber beeinflussten sich gegenseitig über Kontinente hinweg, indem sie den klaren Beweis erbrachten, dass die Kalzium-absondernde Fähigkeit des SR vollständig für die Relaxation verantwortlich ist, während W. Hasselbach die Kalzium-Pumpwirkung des SR präzise definierte (siehe Ref. 13 für eine Übersicht).
Da ich L. D. Peachey in Porters Labor genau verfolgt hatte, war ich mir der durch A. F. Huxelys Ergebnisse initiierten Suche nach einer Verbindung zwischen dem Plasmalemma der Muskelfaser und ihrem Inneren, die eine schnelle Ausbreitung des elektrischen Ereignisses in das Faserinnere ermöglichen würde, durchaus bewusst (14). In ihrer Arbeit von 1957 (3) hatten Porter und Palade eine sich wiederholende Struktureinheit, die Triade, beschrieben, die sich in genauer Beziehung zu den Bändern der Myofibrillen befindet: entweder gegenüber der Z-Linie oder gegenüber der A-I-Verbindung. Die Triade besteht aus 2 SR-Zisternen, die eng gegenüber einem zentralen Tubulus liegen. Die Lage der Triade (3) und ihres zentralen Tubulus (15-17) stimmen mit den Stellen überein, an denen die Einwärtsausbreitung von Kontraktionen infolge lokaler Depolarisation stattfindet (11). Andersson-Cedergren (18) wies anhand von akribischen Serienschnitten nach, dass die zentralen Elemente der Triade ein kontinuierliches Netzwerk über die Muskelfasern hinweg bilden, daher der Name Transversaltubuli (T) für diese Komponenten der Triade. Die Augen der Elektronenmikroskopiker waren also auf die T-Tubuli gerichtet, und ich war auf die Entdeckung vorbereitet, die mich gegen Ende meiner Postdoc-Zeit im Labor von Porter (1963) erwartete. Ich betrachtete Dünnschnitte des Skelettmuskels von Guppys, die in Elisabeth Porters Becken gezüchtet worden waren, und sah plötzlich wiederholt Beispiele für weit geöffnete Mündungen der T-Tubuli am Rand der Faser. Es war leicht, Porters Aufmerksamkeit zu erregen: Ich betrat sein Labor um 10:00-11:00 Uhr, dem üblichen Ende seines Arbeitstages, wenn er sich entspannen konnte, und zeigte ihm meine Negative. Porters Interesse war sofort geweckt. Meine Bilder entsprachen nicht seinen hohen Ansprüchen, also nahm er einen meiner Blöcke, schnitt persönlich dünne Schnitte und machte eine Reihe von Mikrofotografien, jede ein Kunstwerk (Abb. 1A). Porters mikroskopische Aufnahmen bildeten den Großteil der Illustrationen in der endgültigen Publikation, die zeigte, dass die T-Tubuli die wesentlichen Merkmale aufweisen, die für ihre Rolle bei der Ausbreitung der Depolarisation der Oberflächenmembran ins Faserinnere notwendig sind (19, siehe auch Abb. 1B). Die Kontinuität des T-Tubulus-Lumens mit den Extrazellularräumen wurde im selben Jahr auch durch die Penetration von Extrazellularraum-Tracern (20, 21) und einem Fluoreszenzfarbstoff (22) bestätigt. Die Kontinuität der T-Tubuli mit der Oberflächenmembran ist die Grundlage für die große Oberflächenmembrankapazität der Muskelfasern.
Funktionelle Domänen des SR sind entweder mit der Oberflächenmembran oder mit den T-Tubuli assoziiert (Abb. 1C, G) und bilden mit ihnen wohldefinierte Verbindungen, die als Kalziumfreisetzungseinheiten bezeichnet werden (siehe 23, 24 für Übersichtsarbeiten). Während der Erregungs-Kontraktions-Kopplung (E-Kopplung) werden die äußeren Membranen zunächst depolarisiert, und unmittelbar danach setzt der SR Kalzium in die myofibrillären Räume frei. Die strukturelle Frage lautet dann: Wie ist die Beziehung zwischen SR und äußeren Membranen an diesen spezialisierten Verbindungsstellen, die die Übersetzung des elektrischen Ereignisses in die Freisetzung von Kalzium aus dem SR während der Muskelaktivierung ermöglicht? Springt man in der Zeit um ∼25 Jahre vorwärts, lautet die moderne strukturelle Frage bezüglich dieses Schrittes in der E-Kopplung: Was ist die räumliche Beziehung zwischen Proteinen des SR und der äußeren Membranen in den Kalziumfreisetzungseinheiten, und was kann aus dieser Assoziation abgeleitet werden? Vier Proteine des junktionalen SR sind gut identifiziert: die Ryanodinrezeptoren (RyRs), oder SR-Kalziumfreisetzungskanäle (8); Calsequestrin (7, 25); Triadin (26) und Junctin (27). RyRs sind homotetramerische Kalziumkanäle, die aus 4 identischen Untereinheiten mit einer großen zytoplasmatischen Domäne und einer kombinierten Masse von ∼2.000 kDa bestehen und, wenn sie geöffnet sind, ein schnelles Entweichen des SR-Kalziums in die myofibrillären Räume ermöglichen. Die zytoplasmatischen Domänen der RyRs sind im Elektronenmikroskop als Füße sichtbar, die die junktionale SR-Oberfläche mit äußeren Membranen verbinden (Abb. 1C, D). RyRs sind also strategisch günstig gelegen, um mit der Oberflächenmembran zu interagieren. Calsequestrin ist ein luminales Protein der SR-Zisternen, das sich in der Nähe der junktionalen Domänen des SR befindet (Abb. 1B, C). Seine Funktion besteht darin, die Gesamtkapazität für Kalzium des SR-Lumens zu erhöhen und gleichzeitig eine relativ hohe freie Kalziumkonzentration aufrechtzuerhalten, wodurch ein großer Gradient in der ionischen Kalziumkonzentration zwischen dem SR-Lumen und den Myofibrillen ermöglicht wird. Triadin ist wahrscheinlich das Protein, das Calsequestrin an die SR-Oberfläche bindet und es in der Nähe der RyRs hält, und auch Junctin könnte eine ähnliche Rolle spielen. Entweder eines der beiden letztgenannten Proteine oder andere, die noch identifiziert werden müssen, sind dafür verantwortlich, dass Calsequestrin in der Nähe der Kalziumfreisetzungskanäle immobilisiert bleibt. Ein Oberflächenmembranprotein befindet sich an den Junktionsdomänen der äußeren Membranen, die an den Kalziumfreisetzungseinheiten beteiligt sind (23): der L-Typ Kalziumkanal, auch Dihydropyridinrezeptor (DHPR) genannt. DHPRs fungieren sowohl als Spannungssensoren als auch als Kalziumkanäle, und ihre Wirkung ist notwendig, um die Kalziumfreisetzung aus dem SR zu initiieren (28, 29).
Im Skelettmuskel sind die DHPRs in Tetraden oder Gruppen von 4 Komponenten gruppiert, die sich an den Ecken kleiner Quadrate befinden (Abb. 1E, I). DHPR-Tetraden bilden geordnete Arrays, die geordneten Arrays der SR-Füße gegenüberstehen, und zwar so, dass jede der 4 DHPRs, die die Tetrade bilden, mit einer Untereinheit eines darunter liegenden Fußes verbunden zu sein scheint (30, 31). Diese direkte strukturelle Beziehung der beiden Hauptproteine der Kalziumfreisetzungseinheit unterstützt die so genannte „mechanische“ Hypothese der E-Kopplung, die besagt, dass Spannungssensoren in der T-Tubulusmembran (die sich später als die DHPRs herausstellten) die Depolarisation wahrnehmen und die Kalziumfreisetzung aus dem SR durch eine direkte molekulare Interaktion beeinflussen (32). Eine der rätselhaften strukturellen Beobachtungen bezüglich der DHPR-RyR-Beziehung ist, dass Tetraden mit alternativen Füßen assoziiert sind (Abb. 1 M), wodurch eine Reihe von verwaisten Füßen (oder RyRs) übrig bleibt, die nicht direkt mit DHPRs verbunden sind. Vergleichende Arbeiten an einer Vielzahl von Muskeln in vivo und in vitro deuten darauf hin, dass die alternierende Anordnung die Regel für den Skelettmuskel ist, und dass sie nicht vom Vorhandensein von 2 Typen von RyR-Isoformen abhängt.
Die jüngste Erforschung der molekularen und entwicklungsbedingten Grundlagen der DHPR-RyR-Beziehung ist die Arbeit von zwei Postdoktoranden in meinem Labor (Dr. Hiroaki Takekura und Feliciano Protasi) und beinhaltet die Zusammenarbeit mit Dr. P. D. Allen, K. G. Beam, B. E. Flucher und H. Takeshima. Die erste Frage, der wir nachgingen, war, wie die abwechselnde Anordnung der Tetraden während der Entwicklung der Kreuzungen zustande kommt. Diese Frage wurde in Zusammenarbeit mit Dr. B. E. Flucher anhand von Zellen skelettmuskulären Ursprungs in der BC3H1-Zelllinie untersucht, die an der Zellperipherie ko-lokalisierte Cluster von DHPRs, Triadin und RyRs entwickeln (33). Dünnschnitte und Gefrierfrakturen dieser Zellen zeigen gut differenzierte Kalziumfreisetzungseinheiten, die ausgedehnte geordnete Arrays von Füßen und Tetraden enthalten. Die Tetrads haben eine wechselnde Anordnung. Viele der Verzweigungen haben Tetraden mit fehlenden Elementen, und da wir diese sowohl in frühen als auch in späten Tagen in der Kultur finden, nehmen wir an, dass viele davon Verzweigungen im Prozess der Bildung darstellen. Interessanterweise haben Anordnungen von Tetraden, selbst wenn sie ganz unvollständig sind, eine andere Anordnung als Anordnungen von Füßen, was darauf hindeutet, dass diese Beziehung den Wechselwirkungen zwischen den beiden Proteinen innewohnt.
Die zweite Frage ist, ob die Gruppierung der DHPRs in Tetraden nur im Skelettmuskel vorkommt oder auch in Muskeln, die eine andere Basis für die E-Kopplung zu haben scheinen. Der Herzmuskel enthält Isoformen von RyRs und DHPRs, die sich von denen des Skelettmuskels unterscheiden, und sie unterscheiden sich funktionell dadurch, dass die Permeation von Kalzium durch die DHPRs eine Voraussetzung für die e-Kopplung zu sein scheint (34, 35). DHPRs und RyRs des Herzmuskels befinden sich an Stellen, die im Lichtmikroskop kolokalisiert erscheinen (Abb. 1F), genau wie im Skelettmuskel, und diese Nebeneinanderstellung wird früh in der Differenzierung des E-Kopplungsapparates erreicht (36-38). Die Gefrierfrakturierung zeigt jedoch, dass die Anordnung der DHPRs im Herzmuskel anders ist als im Skelettmuskel (vgl. Abb. 1I, K). Die DHPRs befinden sich in der Nähe der Füße, scheinen aber nicht direkt mit ihnen verbunden zu sein (Abb. 1N), so dass ihre Interaktion möglicherweise indirekt über einen Transmitter (z. B. Kalzium) erfolgt.
Die obigen Informationen sind direkt relevant für das Verständnis von 2 Mausmodellen für die Untersuchung der E-Kopplung. In einem Modell fehlt die Hauptuntereinheit (α1) der skelettalen DHPRs. Die Muskeln kontrahieren aufgrund der fehlenden e-Kopplung nicht und entwickeln sich schlecht (daher die Bezeichnung dysgen). Es werden jedoch Triaden mit Arrays von Füßen gebildet, was darauf hindeutet, dass die Anwesenheit von RyRs für die Bildung von SR-Oberflächenverbindungen nicht erforderlich ist. Cluster von DH-PRs (detektiert durch Immunolabeling) und DHPR-Tetraden (detektiert durch Gefrierbruch) fehlen in dysgenen Muskelzellen, werden aber durch Transfektion von kultivierten dysgenen Myotubes mit cDNA für die DHPR wiederhergestellt, was zeigt, dass Tetraden aus DHPRs bestehen (31, 39, 40). Das andere Modell ist eine gezielte Null-Mutation des Skelett-Typs RyR, die ebenfalls zu einer Blockierung der e-Kopplung führt. Muskelfasern, denen RyR fehlt, bilden überraschenderweise Triaden (41) (Abb. 1H). Die Triaden haben keine Füße, daher die Bezeichnung dyspedisch, erscheinen aber ansonsten in Dünnschnitten normal. Einer Zelllinie (1B5), die aus einer dyspedischen Mutation entwickelt wurde, fehlt ebenfalls die e-Kopplung. Mit diesen Zellen haben wir gezeigt, dass trotz des Fehlens von Füßen dyspedische SR-Oberflächenverbindungen gebildet werden und Triadin und DH-PRs enthalten (42). Bei Gefrierbruch aggregieren die an dyspedischen Verbindungen befindlichen Cluster von DH-PRs jedoch nicht zu Tetraden (Abb. 1L). Die Expression von cDNA, die für den Skelettmuskeltyp 1 RyR kodiert, in 1B5-Zellen führt zur Bildung von peripher gelegenen RyR-Spots (Abb. 1P) und zur Clusterung von DHPR in Tetraden (Abb. 1Q). DHPRs brauchen also nicht die Anwesenheit von RyRs, um an SR-Oberflächen-Junktionsstellen zu clustern, aber sie brauchen eine Interaktion mit skelettartigen RyRs, um Tetraden zu bilden. Dies bestätigt auch indirekt, dass eine Verbindung zwischen RyR und DHPRs in Skelettmuskelfasern existiert. Umgekehrt deutet das Fehlen von Tetraden im Herzmuskel darauf hin, dass entweder eine RyR-DHPR-Verbindung nicht vorhanden ist oder dass die Verbindung anders ist als die im Skelettmuskel. Sowohl das Vorhandensein der RyR-DHPR-Verknüpfung als auch deren Fehlen oder Unterschied haben tiefgreifende funktionelle Auswirkungen auf die E-Kopplung. K. R. Porter hätte diesen Entwicklungen in unserem Verständnis der SR zugestimmt, weil sie auf genau definierbaren Struktur-Funktions-Beziehungen beruhen.