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2.1. Wachstumseigenschaften von S. boulardii

Um diese Hefe weiter zu charakterisieren, werden ihre Wachstumseigenschaften bei verschiedenen Temperaturen mit anderen diploiden Hefestämmen verglichen (alle verwendeten Hefestämme sind in Tabelle 1 zusammengefasst). S. boulardii (ich werde diesen Namen im Text beibehalten, obwohl es sich um einen S. cerevisiae-Stamm handelt) wächst gut auf reichhaltigem Medium bei 30°C sowie bei 37°C, aber nicht bei 40°C (Abbildung 1A). Wachstum bei 37°C – obwohl nicht ideal – ist für Hefestämme wie den diploiden Stamm BY4743 (ein Derivat von S288C) nicht ungewöhnlich, aber im Gegensatz zum diploiden Stamm RH2585/2586 (ein Σ1278b-Derivat), der bei 37°C kaum wächst (Abbildung 1A). In diesem Sinne ist das Wachstum bei 37°C keine besondere und einzigartige Eigenschaft von S. boulardii. Es spiegelt wahrscheinlich eher seine Anpassung an heiße Klimazonen wider, wie sie in Indochina häufig anzutreffen sind.

Eine weitere untersuchte Eigenschaft ist die potentielle Fähigkeit von S. boulardii, Fäden zu bilden. Dazu wurde es auf SLAD-Platten kultiviert, die nur begrenzte Konzentrationen von Ammoniumsulfat (50 μM, etwa 1000× weniger als herkömmliches SD-Minimalmedium) enthalten. Wie unter dem Mikroskop beobachtet, zeigt der diploide Stamm RH2585/2586 unter solchen ammoniumlimitierenden Bedingungen deutlich filamentöse Eigenschaften (Abbildung 1B) . Die Deletion des FLO8-Gens, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert, der für die Filamentierung und Adhäsion erforderlich ist, hob die filamentösen Eigenschaften vollständig auf. Flo8 wird benötigt, um z. B. Flo11, ein Zelloberflächen-Glykoprotein, zu exprimieren. Im Gegensatz zu RH2585/2586 zeigte S. boulardii kaum Filamentierungseigenschaften. Interessanterweise zeigte die Sequenzierung des PCR-amplifizierten FLO8-Gens von S. boulardii, dass es kein vorzeitiges Stoppcodon trägt (nicht gezeigt), das in nicht-filamentösen Hefestämmen wie denen aus S288C gefunden wurde. Daher sind andere vor- oder nachgeschaltete Gene, die für die Filamentierung benötigt werden, in S. boulardii wahrscheinlich dysfunktional. Die fehlende Filamentierung erklärt wahrscheinlich die geringe Toxizität und die fehlende Etablierungsfähigkeit im Magen-Darm-Trakt, die ihn sonst hartnäckiger und damit für medizinische Anwendungen problematischer machen könnte.

Eine weitere interessante Fragestellung war es, in S. boulardii Meiose und Sporulation zu induzieren, um haploide Nachkommen zu erhalten. Dazu wurden diploide Zellen in einem flüssigen Medium mit limitierendem Stickstoff und sehr hoher Kaliumacetatkonzentration als (armer) Kohlenstoffquelle inkubiert. Trotz mehrerer Versuche wurde keine Tetradenbildung beobachtet. In dieser Hinsicht zeigt S. boulardii ähnliche Eigenschaften wie RH2585/2586 (das in dieser Arbeit verwendete filamentöse Diploid), das bei Behandlung unter den beschriebenen Bedingungen keine Tetraden bildet. Um Meiose und Sporulation zu induzieren, wurde ein doppelter Knockout von RME1 (Regulator of Meiosis 1) in S. boulardii hergestellt. RME1 ist ein negativer Regulator der Meiose, der die Expression von Meiose-relevanten Proteinen wie IME1 (Inducer of Meiosis 1) verhindert und die Mitose fördert. Das S. boulardii ∆∆rme1-Derivat zeigte keine phänotypischen Unterschiede zum elterlichen Wildtyp-Stamm in Bezug auf die Wachstumstemperatur (Abbildung 1A). Leider wurden auch von diesem Knockout-Stamm keine Tetraden erhalten. Daraus schließe ich, dass S. boulardii zumindest unter den hier verwendeten Laborbedingungen keine Meiose und haploide Tetradenbildung durchläuft.

Wie in Abbildung 1C gezeigt, trägt S. boulardii keine auxotrophen Marker, da es auf Minimalmedium (SD) ohne Aminosäuren oder Nukleinsäurekomponenten wie Adenin oder Uracil gut wächst. Auxotrophe Markergene konnten leicht durch Deletion der Gene ADE2 (Adenin-Biosynthese) oder HIS3 (Histidin-Biosynthese) erhalten werden (Abbildung 1C). Diese Deletionen wurden durch die Einführung dominanter auxotropher Markergene erhalten, die Resistenz gegen die Antibiotika Kanamycin/G418 oder Nourseothricin verleihen. Die Deletion einer einzelnen Genkopie von ADE2 oder HIS3 ermöglichte immer noch ein Wachstum auf Minimalmedium-Platten (nicht gezeigt), was auf den eindeutigen diploiden Charakter dieser Hefe hinweist. Erst die doppelte Deletion beider HIS3- oder ADE2-Genkopien (was sie sowohl gegen Kanamycin/G418 als auch gegen Nourseothricin resistent machte; Abbildung 1C) machte diesen Hefestamm auxotroph für Histidin oder für Adenin. Die neu gewonnene Histidin-Auxotrophie wurde in einem nachfolgenden Experiment genutzt, um ihn mit Hefeplasmiden zu transformieren, die HIS3 als selektierbares Markergen tragen (siehe nachfolgenden Text).