Das Klonen von DNA kann spontan von der Zelle zu Fortpflanzungszwecken durchgeführt werden. Dabei handelt es sich um eine Form der ungeschlechtlichen Fortpflanzung, bei der sich ein Organismus in Fragmente aufspaltet und jedes dieser Fragmente sich zu reifen, ausgewachsenen Individuen entwickelt, die Klone des ursprünglichen Organismus sind (siehe Reproduktionsfragmentierung).DNA-Klonen kann auch absichtlich von Laborforschern durchgeführt werden. Hier ist die DNA-Fragmentierung eine molekulargenetische Technik, die es den Forschern erlaubt, mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie eine große Anzahl identischer DNA-Moleküle herzustellen.Für das DNA-Klonen ist es notwendig, diskrete, kleine Bereiche der DNA eines Organismus zu erhalten, die spezifische Gene darstellen. Nur relativ kleine DNA-Moleküle können in jedem verfügbaren Vektor geklont werden. Daher müssen die langen DNA-Moleküle, aus denen das Genom eines Organismus besteht, in Fragmente gespalten werden, die in die Vektor-DNA eingefügt werden können. Zwei Enzyme erleichtern die Herstellung solcher rekombinanter DNA-Moleküle:
1. RestriktionsenzymeRestriktionsenzyme sind von Bakterien produzierte Endonukleasen, die typischerweise kleine Basenpaar-Sequenzen (sogenannte Restriktionsstellen) erkennen und dann beide Stränge der DNA an dieser Stelle spalten. Eine Restriktionsstelle ist typischerweise eine palindromische Sequenz, was bedeutet, dass die Sequenz der Restriktionsstelle auf jedem DNA-Strang gleich ist, wenn sie in 5′- zu 3′-Richtung gelesen wird.Für jedes Restriktionsenzym produzieren die Bakterien auch ein Modifikationsenzym, so dass die eigene DNA des Wirtsbakteriums vor der Spaltung geschützt wird. Dies geschieht durch Modifikation der Wirts-DNA an oder in der Nähe jeder potentiellen Spaltstelle. Das Modifikationsenzym fügt eine Methylgruppe an eine oder zwei Basen an, und die Anwesenheit dieser Methylgruppe verhindert, dass die Restriktionsendonuklease die DNA schneidet.
Viele Restriktionsenzyme machen an ihrer Erkennungsstelle gestaffelte Schnitte in die beiden DNA-Stränge, Dadurch werden Fragmente mit einem einzelsträngigen „Schwanz“ erzeugt, der an beiden Enden überhängt, was als stumpfes Ende bezeichnet wird. Restriktionsenzyme können auch gerade Schnitte in die beiden DNA-Stränge an ihrer Erkennungsstelle machen, was stumpfe Enden erzeugt. 2. DNA-LigaseWährend der normalen DNA-Replikation katalysiert die DNA-Ligase die Ende-zu-Ende-Verknüpfung (Ligation) von kurzen DNA-Fragmenten, den sogenannten Okazaki-Fragmenten. Für die Zwecke der DNA-Klonierung wird gereinigte DNA-Ligase verwendet, um die Enden eines Restriktionsfragments und Vektor-DNA, die komplementäre Enden haben, kovalent zu verbinden. Die DNA-Ligase kann komplementäre klebrige und stumpfe Enden ligieren, aber die Ligation von stumpfen Enden ist ineffizient und erfordert eine höhere Konzentration von DNA und DNA-Ligase als die Ligation von klebrigen Enden. Aus diesem Grund machen die meisten Restriktionsenzyme, die bei der DNA-Klonierung verwendet werden, gestaffelte Schnitte in die DNA-Stränge, um sticky ends zu erzeugen.
Der Schlüssel zum Klonen eines DNA-Fragments besteht darin, es mit einem Vektor-DNA-Molekül zu verbinden, das sich in einer Wirtszelle replizieren kann. Nachdem ein einzelnes rekombinantes DNA-Molekül (bestehend aus einem Vektor plus einem eingefügten DNA-Fragment) in eine Wirtszelle eingeführt wurde, kann die eingefügte DNA zusammen mit dem Vektor repliziert werden, wodurch eine große Anzahl identischer DNA-Moleküle entsteht.Das grundlegende Schema hierfür lässt sich wie folgt zusammenfassen:
Vektor + DNA-Fragment↓ Rekombinante DNA↓ Replikation der rekombinanten DNA in der Wirtszelle↓ Isolierung, Sequenzierung und Manipulation des gereinigten DNA-Fragments
Es gibt zahlreiche experimentelle Variationen dieses Schemas, aber diese Schritte sind essentiell für das DNA-Klonen in einem Labor.