Kalibrierkurven werden verwendet, um die Reaktion des Geräts auf einen Analyten zu verstehen und die Konzentration des Analyten in einer Probe vorherzusagen.
Eine Kalibrierkurve wird erstellt, indem zunächst eine Reihe von Standardlösungen mit bekannten Konzentrationen des Analyten hergestellt wird. Das Ansprechverhalten des Geräts wird für jede Lösung gemessen und gegen die Konzentration der Standardlösung aufgetragen. Der lineare Teil dieses Diagramms kann dann verwendet werden, um die Konzentration einer Probe des Analyten vorherzusagen, indem das Ansprechverhalten mit der Konzentration korreliert wird.
In diesem Video werden Kalibrierkurven und ihre Verwendung vorgestellt, indem die Vorbereitung eines Satzes von Standards und die anschließende Analyse einer Probe mit unbekannter Konzentration demonstriert werden.
Zur Vorbereitung der Kalibrierkurve wird ein Satz von Standardlösungen verwendet. Diese Lösungen bestehen aus einem Bereich von Konzentrationen, die die ungefähre Konzentration des Analyten umfassen.
Standardlösungen werden oft mit einer seriellen Verdünnung hergestellt. Eine serielle Verdünnung wird durchgeführt, indem zunächst eine Stammlösung des Analyten hergestellt wird. Die Stammlösung wird dann um eine bekannte Menge verdünnt, oft um eine Größenordnung. Die neue Lösung wird dann auf die gleiche Weise verdünnt, und so weiter. Das Ergebnis ist eine Reihe von Lösungen mit Konzentrationen, die über mehrere Größenordnungen reichen.
Die Kalibrierkurve ist eine Darstellung des instrumentellen Signals gegen die Konzentration. Der Verlauf der Standards sollte linear sein und kann mit der Gleichung y=mx+b angepasst werden. Die nichtlinearen Teile der Kurve sollten verworfen werden, da diese Konzentrationsbereiche außerhalb der Linearitätsgrenze liegen.
Die Gleichung der Best-Fit-Linie kann dann verwendet werden, um die Konzentration der Probe zu bestimmen, indem das Instrumentensignal mit der Konzentration korreliert wird. Proben, deren Messwerte außerhalb des linearen Bereichs der Kurve liegen, müssen verdünnt werden, um in den linearen Bereich zu gelangen.
Aus der Kalibrierkurve lässt sich auch die Nachweisgrenze des Geräts oder der niedrigste Messwert, der statistisch über dem Rauschen bestimmt werden kann, berechnen. Eine Blindprobe wird mehrfach gemessen. Die Nachweisgrenze ist in der Regel definiert als das mittlere Blindsignal plus 3 mal dessen Standardabweichung.
Schließlich kann auch die Bestimmungsgrenze berechnet werden. Die Bestimmungsgrenze ist die niedrigste Menge des Analyten, die genau quantifiziert werden kann. Sie wird als 10 Standardabweichungen über dem Leersignal berechnet.
Nachdem Sie nun die Grundlagen einer Kalibrierkurve kennengelernt haben, sehen wir uns an, wie Sie eine solche im Labor erstellen und verwenden können.
Zuerst bereiten Sie eine konzentrierte Stammlösung des Standards vor. Wiegen Sie den Standard genau ab und füllen Sie ihn in einen Messkolben. Geben Sie eine kleine Menge Lösungsmittel hinzu und mischen Sie, damit sich die Probe auflöst. Füllen Sie dann bis zur Linie mit Lösungsmittel auf. Es ist wichtig, dass das gleiche Lösungsmittel wie die Probe verwendet wird.
Um die Standards herzustellen, pipettieren Sie die benötigte Menge in den Messkolben. Füllen Sie dann den Kolben bis zur Linie mit Lösungsmittel und mischen Sie.
Weiterhin werden die Standards durch Pipettieren aus der Stammlösung und Verdünnen hergestellt. Für eine gute Kalibrierkurve werden mindestens 5 Konzentrationen benötigt.
Nun führen Sie Proben mit dem Analysegerät, in diesem Fall ein UV-Vis-Spektralphotometer, durch, um die für die Kalibrierkurve benötigte instrumentelle Reaktion zu bestimmen.
Messen Sie den ersten Standard. Führen Sie die Standards in zufälliger Reihenfolge aus, falls es systematische Fehler gibt. Messen Sie jeden Standard 3-5x, um eine Abschätzung des Rauschens zu erhalten.
Messen Sie den Rest der Standards und wiederholen Sie die Messungen für jeden Standard. Zeichnen Sie alle Daten auf.
Schließlich führen Sie die Probe durch. Verwenden Sie die gleiche Probenmatrix und die gleichen Messbedingungen wie für die Standards. Stellen Sie sicher, dass die Probe innerhalb des Bereichs der Standards und der Grenze des Geräts liegt.
Um die Kalibrierkurve zu erstellen, verwenden Sie ein Computerprogramm, um die Daten als Signal gegen die Konzentration aufzuzeichnen. Verwenden Sie die Standardabweichung der wiederholten Messungen für jeden Datenpunkt, um Fehlerbalken zu erstellen.
Entfernen Sie Teile der Kurve, die nicht linear sind, führen Sie dann eine lineare Regression durch und bestimmen Sie die Linie mit der besten Anpassung. Das Ergebnis sollte eine Gleichung in der Form y = m x + b sein. Ein R2-Wert nahe 1 bedeutet eine gute Anpassung.
Dies ist die Kalibrierkurve für den blauen Farbstoff Nr. 1, gemessen bei 631 nm. Die Reaktion ist linear zwischen 0 und 15 mM.
Berechnen Sie die Konzentration der Probe anhand der Gleichung der Best-Fit-Linie. Die Absorption für die Probe betrug 0,141 und entsprach einer Konzentration von 6,02 mM.
Nachdem Sie nun gesehen haben, wie eine Kalibrierungskurve mit einem UV-Vis-Spektralphotometer verwendet werden kann, lassen Sie uns einen Blick auf einige andere nützliche Anwendungen werfen.
Kalibrierungskurven werden häufig bei elektrochemischen Anwendungen verwendet, da das Elektrodensignal auf die Konzentration der Ionen in der Lösung kalibriert werden muss. In diesem Beispiel wurden Daten für eine ionenselektive Elektrode für Fluorid gesammelt.
Die Konzentrationsdaten müssen auf der logarithmischen Skala aufgetragen werden, um eine Linie zu erhalten. Diese Kalibrierkurve kann verwendet werden, um die Konzentration von Fluorid in einer Lösung, wie z. B. Zahnpasta oder Trinkwasser, zu messen.
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Trenn- und Analysetechnik, die in der analytischen Chemie häufig eingesetzt wird. HPLC trennt die Komponenten eines Gemischs anhand der Zeit, die die Moleküle benötigen, um die Länge der Chromatographiesäule zu durchlaufen. Diese Zeit variiert in Abhängigkeit von einer Reihe chemischer Eigenschaften der Moleküle.
Die Elution der Moleküle wird mit einem Detektor gemessen, wodurch ein Chromatogramm entsteht. Die Peakfläche kann mit Hilfe einer einfachen Kalibrierungskurve einer Reihe von Standardlösungen mit der Konzentration korreliert werden, wie in diesem Beispiel für beliebte Limonadenbestandteile.
In einigen Fällen, in denen die Lösungsmatrix die Messung des gelösten Stoffes stört, kann eine klassische Kalibrierungskurve ungenau sein. In diesen Fällen wird eine modifizierte Kalibrierkurve erstellt. Dazu wird der Probe ein Bereich von Standardlösungsvolumina zugesetzt. Es wird ein Signal-Konzentrations-Diagramm erstellt, bei dem der x-Achsenabschnitt gleich der ursprünglichen Konzentration der Probenlösung ist. Für weitere Details zu dieser Technik sehen Sie sich bitte das JoVE-Bildungsvideo „Die Methode der Standardaddition“ an.
Sie haben soeben die Einführung in die Kalibrierkurve von JoVE gesehen. Sie sollten jetzt verstehen, wo die Kalibrierkurve verwendet wird, wie man sie erstellt und wie man sie verwendet, um Konzentrationen von Proben zu berechnen.
Wie immer, danke fürs Zuschauen!