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Nach ihrer Ausbildung in Yale, wo sie bei Earle R. Gister studierte und in einer Reihe von Shakespeare-Stücken auftrat, erlangte Lathan sowohl am Off-Broadway als auch auf der Bühne in Los Angeles Anerkennung. Von ihrem Vater ermutigt, Los Angeles zu ihrer professionellen Basis zu machen, fand sie frühe Fernsehrollen in Episoden von Shows wie In the House, Family Matters, NYPD Blue und Moesha.

Im Jahr 1998 erlangte Lathan einen gewissen Bekanntheitsgrad mit ihrer Rolle als Mutter von Wesley Snipes‘ Titelfigur in Blade. Im darauffolgenden Jahr folgte eine Rolle in Life mit Martin Lawrence und Eddie Murphy sowie zwei weitere Rollen in The Best Man und The Wood. The Best Man war ein komödiantischer Ensemble-Film, in dem Taye Diggs, Nia Long, Harold Perrineau Jr. und Morris Chestnut mitspielten. The Best Man wurde zu einem der zehn umsatzstärksten afroamerikanischen Filme der Geschichte und Lathan erhielt eine NAACP Image Award Nominierung für ihre Leistung. In The Wood, einem weiteren Ensemble-Film mit Diggs und Omar Epps, spielte sie die Rolle des Love Interest von Epps.

Lathan und Epps waren in Gina Prince-Bythewoods Love & Basketball wieder auf der Leinwand zu sehen, diesmal als ein Paar, das genauso leidenschaftlich für Basketball ist wie füreinander. Ihre Leistung in Love & Basketball brachte ihr 2001 den NAACP Image Award für Outstanding Actress in a Motion Picture ein, sowie eine Independent Spirit Award Nominierung als beste Schauspielerin und einen BET Award. Im Jahr 2000 spielte Lathan in der Off-Broadway-Produktion von The Vagina Monologues an der Seite von Teri Garr und Julianna Margulies.

Im Jahr 2001 erntete Lathan weitere Anerkennung für ihre Arbeit in der multikulturellen Filmkomödie Catfish in Black Bean Sauce. Es folgte ihre zweite Zusammenarbeit mit Prince-Bythewood: Disappearing Acts; der Film basiert auf einem Roman von Terry McMillan. In dem HBO-Film spielt Lathan eine aufstrebende Singer/Songwriterin, die in einen Schreiner verliebt ist, der von ihrem Blade-Co-Star Wesley Snipes gespielt wird. Für ihre Arbeit in dem Film erhielt Lathan einen Essence Award als beste Schauspielerin. Im selben Jahr wurde sie von der Zeitschrift Ebony zu einer der 55 schönsten Menschen ernannt und von der Zeitschrift Essence und Black Entertainment Television geehrt. 2002 spielte Lathan in der romantischen Komödie Brown Sugar an der Seite von Diggs, Queen Latifah und Mos Def. Lathans Leistung brachte ihr eine NAACP Image Award Nominierung als Outstanding Actress in a Motion Picture ein. Der Film erhielt auch eine NAACP Image Award Nominierung für Outstanding Motion Picture.

Im Jahr 2004 spielte Lathan am Broadway die Hauptrolle in A Raisin in the Sun mit Sean Combs, Audra McDonald und Phylicia Rashad. Für ihre Darstellung der Beneatha Younger erhielt Lathan eine Tony Award-Nominierung für die beste Leistung einer Hauptdarstellerin. Einige Jahre später spielte Lathan die Rolle erneut in einer ABC Network Produktion von A Raisin in the Sun.

Im Jahr 2003 spielte sie eine Nebenrolle mit Denzel Washington in Out of Time. Im folgenden Jahr wurde sie für die Hauptrolle in Alien vs. Predator gecastet. Der Film war ein großer Erfolg und spielte weltweit über 171 Millionen Dollar ein.

2006 spielte sie neben Simon Baker in Something New, einer romantischen Komödie; als Michelle Landau, die viel jüngere Frau eines texanischen Geschäftsmannes (Larry Hagman) in der vierten Staffel der Fernsehserie Nip/Tuck; und 2008 als Andrea in Tyler Perrys The Family That Preys. Der Film, in dem auch Alfre Woodard und Kathy Bates mitspielen, wurde am 12. September 2008 in den USA veröffentlicht. In einem Interview mit NPR sagte Lathan, dass das Drehbuch einen neuen Ansatz verfolgte, um eine interrassische Liebesgeschichte zu erzählen, indem es den inneren Konflikt beschreibt, mit dem einige afroamerikanische Frauen konfrontiert sind, wenn es um interrassische Beziehungen geht. „Ich habe das Gefühl, dass es für schwarze Frauen in gewisser Weise schwieriger ist, sich in diese Richtung zu bewegen, allein schon kulturell gesehen. Ich weiß, dass es diese Statistik gibt, die besagt, dass etwa 13 Prozent der schwarzen Männer in gemischtrassigen Beziehungen sind. Und ich glaube, das sagt viel aus über die Loyalität schwarzer Frauen zu ihren schwarzen Männern oder über ihre Schuldgefühle, wenn sie sich außerhalb ihrer Rasse bewegen.“

Im Jahr 2009 spielte Lathan neben Matthew Broderick in dem Drama Wonderful World. Von 2009 bis 2013 verkörperte sie die Figur Donna Tubbs in The Cleveland Show. 2011 spielte Lathan in dem Steven Soderbergh-Thriller Contagion neben Matt Damon, Jude Law, Marion Cotillard, Kate Winslet, Gwyneth Paltrow, Bryan Cranston und Laurence Fishburne. 2011 spielte Lathan neben Anthony Mackie und Forest Whitaker in Repentance, einem Psychothriller unter der Regie von Phillipe Caland.

Lathan spielte die Hauptrolle der Mona Fredricks in der zweiten Staffel der Starz-Serie Boss mit Kelsey Grammer in der Hauptrolle.

Im Jahr 2013 wiederholte Lathan ihre Rolle in der Fortsetzung The Best Man′s, The Best Man Holiday. 2016 gehörte sie zum Ensemble der Fortsetzung von „Now You See Me“ mit dem Titel „Now You See Me 2“, die ein Kassenschlager war, und sie spielte in dem Sci-Fi-Film „Approaching the Unknown“ mit. Im Jahr 2017 kehrte Lathan in einer Hauptrolle in der Serie Shots Fired ins Fernsehen zurück und spielte auch in dem Film American Assassin mit. Danach wurde Lathan zur Hauptbesetzung der Serie The Affair hinzugefügt, in deren vierter und fünfter Staffel sie auftrat, und spielte die Hauptrolle in dem Netflix-Film Nappily Ever After.