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Ergebnisse

Gesamtstruktur des E. coli Ivy-Proteins.

Das vom ykfE-Gen kodierte Protein wurde im Rahmen eines Strukturgenomik-Projekts exprimiert und gereinigt, das systematisch auf E. coli-Gene mit unbekannter Funktion abzielt. Durch einen glücklichen Zufall wurde festgestellt, dass das YkfE-Protein mit HEWL, das im routinemäßigen bakteriellen Aufschlussprotokoll verwendet wird, kopurifiziert und dann kokristallisiert. Das YkfE-Protein wurde anschließend als potenter und spezifischer Inhibitor für C-Typ-Lysozym charakterisiert (7), und der Genname wurde in Ivy (Inhibitor von Vertebraten-Lysozym) geändert, um diese Eigenschaft zu reflektieren. Hochauflösende Kristallstrukturen wurden für E. coli Ivy (Ivyc) sowohl in Isolation als auch im Komplex mit Lysozym erhalten.

Beschreibung der Struktur.

Wir haben zuvor durch Gelfiltrations- und Fluoreszenzstudien gezeigt, dass das periplasmatische Ivyc-Homodimer die physiologisch aktive Einheit ist, mit einem Dimerisierungs-K d im Bereich von 10-9 M (7). Das Ivyc-Protein kristallisierte als Dimer. Die kristalline asymmetrische Einheit enthält drei Moleküle, die einem nichtkristallographischen Dimer und einem Monomer entsprechen. Unter Anwendung der kristallographischen Symmetrie rekonstruiert dieses Monomer das physiologische Dimer. Jedes Monomer besteht aus einem zentralen β-Faltblatt aus fünf antiparallelen β-Strängen, das auf der konvexen Seite von zwei kurzen Helices (α1, α2; sechs bzw. acht Reste) und auf der konkaven Seite von einer amphipatischen Helix (α4; 11 Reste) flankiert wird (Abb. 1). Wir suchten nach strukturellen Homologen dieser Domäne mit Hilfe des Programms DALI (8). Die beste strukturelle Übereinstimmung in der PDB ist die 306-aa große Histon-Acetyltransferase (PDB-Code 1BOB) aus Hefe (Z = 5,2), mit nur 9 % identischen Resten über 89 Aminosäuren und einem rmsd von 4,0 Å. Allerdings ist die Topologie der beiden Strukturen deutlich unterschiedlich, so dass die Ivy-Struktur eine neuartige Faltung darstellt. Die Dimerstruktur weist eine hufeisenförmige Faltung auf, die auf den beiden antiparallelen amphipatischen Helices (α4) zentriert ist (Abb. 1 b). Im Kristall gibt es 1.605 Å2 vergrabene Oberfläche zwischen den beiden Monomeren, die durch die kristallographische 2-fach-Achse verbunden sind (Monomer A) und 1.432 Å2 vergrabene Oberfläche zwischen den beiden Monomeren, die durch die nicht-kristallographische 2-fach-Achse verbunden sind (Monomere B und C). Der rmsd zwischen den drei Monomeren reicht von 0,547 Å (B/C) bis 0,865 Å über 122 Reste (A/B), basierend auf der Cα-Superimposition. Die Struktur zeigt, dass das Dimer Wechselwirkungen zwischen Rückgrat und Seitenketten von Resten beinhaltet, die alle im C-terminalen Teil des Moleküls im β6-Strang und den α4- und α5-Helices versammelt sind (Abb. 2 b). Diese Reste sind in verschiedenen E. coli-Stämmen, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae und Burkholderia cepacia homologen Sequenzen konserviert, was darauf hindeutet, dass das Ivy-Protein in diesen Bakterien ein funktionelles Dimer und in den anderen Ivy-haltigen Bakterien wahrscheinlich monomer ist.

Mechanismus der Lysozym-Hemmung: Die Ivyc-HEWL-Komplexstruktur (PDB-Code 1GPQ).

Die kristalline asymmetrische Einheit enthält ein nicht-kristallographisches Homodimer von Ivyc im Komplex mit zwei Molekülen von HEWL. Es gibt zwei Arten von Ivyc/HEWL-Wechselwirkungen: die Hauptwechselwirkung, die eine 969-Å2 große vergrabene Oberfläche zwischen einem Ivyc-Monomer und einem HEWL-Molekül beinhaltet, und eine sekundäre Wechselwirkung, die eine 552-Å2 große vergrabene Oberfläche zwischen dem zweiten Ivyc-Monomer und demselben HEWL-Molekül beinhaltet, wodurch eine 1.340-Å2 große vergrabene Oberfläche zwischen dem Ivyc-Homodimer und dem ersten HEWL-Molekül entsteht (Abb. 2 a). Für das zweite HEWL-Monomer beträgt die vergrabene Oberfläche 1.043 Å2 für die Hauptwechselwirkung und 623 Å2 für die Sekundärwechselwirkung, was zu einer insgesamt 1.361 Å2 großen vergrabenen Oberfläche zwischen dem Ivyc-Homodimer und dem zweiten HEWL-Molekül führt.

Die Struktur des Komplexes bestätigt die experimentelle Stoechiometrie der Wechselwirkung zwischen Ivyc und HEWL (7) und deutet unmittelbar auf den Mechanismus der Lysozymhemmung durch das Ivyc-Molekül hin. Durch die Bildung des Ivyc/HEWL-Komplexes wird das aktive Zentrum von Lysozym durch eine Schleife verschlossen, die aus dem Ivyc-Molekül herausragt (Abb. 2 c und d). In der Mitte dieser Schleife bildet ein Histidinrest (H60) Wasserstoffbrückenbindungen mit zwei der drei für die enzymatische Aktivität des Lysozyms verantwortlichen Reste (D52 und E35). Das mit Ivyc komplexierte Lysozym-Molekül zeigt keine signifikante Strukturänderung (rmsd ≈0,5 Å über 127 Reste basierend auf der Cα-Überlagerung von 1HEL mit den Lysozym-Molekülen im Kristall). Allerdings ist ein Wassermolekül aus dem Lysozym-Aktivzentrum ausgeschlossen und durch das Histidin der Ivyc-Inhibitionsschleife ersetzt.

Der Vergleich der verfeinerten Strukturen von Ivyc in Isolation bzw. komplexiert mit HEWL (Abb. 2 b und SI-Tabelle 2) zeigt einige kleinere Konformationsänderungen. Dazu gehört die Orientierung der kleinen Helix (α3) in den drei Monomeren der freien Ivyc-Form. Die in Molekül A beobachtete Orientierung kommt derjenigen am nächsten, die im mit HEWL komplexierten Ivyc-Dimer beobachtet wurde. Drei 310-Helices (η1, η2 und η3), die in der Ivyc/HEWL-Struktur zu sehen sind, fehlen in den drei unkomplexierten Ivy-Molekülen. Noch überraschender ist, dass die hervorstehende Ivy-Schleife, die direkt mit dem aktiven Lysozymzentrum interagiert, keine merkliche Konformationsänderung zwischen den beiden Kristallformen aufweist. Die Starrheit dieser recht kurzen Schleife kann durch das Vorhandensein einer Disulfidbindung (C57-C62) und einer Salzbrücke zwischen dem Lysinrest (K58) neben dem ersten Cystein und dem Aspartatrest (D61) neben dem zweiten Cystein erklärt werden. Diese strukturellen Zwänge, die auf eine Art Schlüssel-Schloss-Interaktion mit C-Typ-Lysozymen hindeuten, könnten die strikte Konservierung der Schleifensequenz zwischen einer Untergruppe von Ivy-Homologen (Ivyc-Orthologen) selbst in entfernt verwandten Bakterien erklären (Abb. 3 und SI Abb. 5).

Funktionsstudien: Charakterisierung von ΔIvy E. coli Mutanten.

Die zentrale Rolle der CKPHDC-Schleife bei der Inhibition wurde experimentell durch gerichtete Mutagenese validiert. Es wurden Aminosäure-Substitutionen durchgeführt, um den Einfluss einiger der wichtigsten interagierenden Reste zu untersuchen, wie es die Struktur des Ivyc/HEWL-Komplexes nahelegt. Wie erwartet, beobachteten wir eine geringere hemmende Aktivität für die Histidin (H60)-Mutanten. Der drastischste Effekt (300-fache Erhöhung von K i) wurde beobachtet, wenn ein negativ geladener Asparaginsäure-Rest an dieser Position eingeführt wurde (SI-Tabelle 3). Dieser Effekt wird höchstwahrscheinlich durch eine abstoßende Wechselwirkung mit den beiden sauren Resten des aktiven Zentrums von Lysozym (D52 und E35) verursacht. Andererseits wurde keine signifikante Änderung der inhibitorischen Aktivität beobachtet, wenn eine C62 → A62-Mutation eingeführt wurde, die die Disulfidbrücke unterbricht.

Wir führten einen Knockout des E. coli Efeu-Gens durch, um die in vivo-Schutzwirkung des Ivy-Proteins in Gegenwart von Lysozym zu beurteilen. Der alleinige Knockout des Ivy-Gens in E. coli zeigte keinen Phänotyp erhöhter Empfindlichkeit gegenüber HEWL und bestätigte damit, dass Lysozym unter Laborbedingungen die Bakterienwand nicht durchdringt (9). Anschließend konstruierten wir eine Doppelmutante durch Einführung einer TolB-pal-Deletion, um den zuvor beschriebenen Phänotyp der „porösen Zellwand“ zu reproduzieren (10). Zuvor wurde gezeigt, dass E. coli ΔtolB-Mutanten aufgrund einer gestörten Hüllensynthese einen typischen Phänotyp mit Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten und Detergenzien, Undichtigkeit und Bildung von Vesikeln an der Außenmembran zeigen (10, 11). Wir haben die Empfindlichkeit gegenüber Lysozym der ΔtolBΔivy-Doppelmutante im Vergleich zur ΔtolB-Mutante (JC864) gemessen. Unter Laborbedingungen erwies sich die ΔtolB-Mutante als empfindlich gegenüber Lysozym-Konzentrationen, die höher waren als die in den Sekreten (>50 μg-ml-1; SI Abb. 6), was zeigt, dass neben kleinen Molekülen auch proteingroße Moleküle in solche undichten E. coli-Zellen eindringen können. Die ΔtolBΔivy-Mutante wurde dann getestet und zeigte eine höhere Empfindlichkeit gegenüber HEWL, da bereits bei physiologischen Konzentrationen (50 μg-ml-1; Abb. 4 a) der Lysozym-Effekt auf das Bakterienwachstum sichtbar war, was die schützende Rolle von Ivyc unterstützt. Dieser schützende Effekt wurde durch Überexpression von Ivyc in einer ΔtolBΔivy-Doppelmutante, die ein Isopropyl-β-d-thiogalactosid-induzierbares Expressionsplasmid trägt, weiter bestätigt (Abb. 4 b), wobei die Ivyc-Expression in der Lage war, das bakterielle Wachstum für Lysozym-Konzentrationen bis zu 500 μg-ml-1 wiederherzustellen. Ähnliche Ergebnisse sind auch im Zusammenhang mit anderen permeabilisierenden Behandlungen beschrieben worden (9).

Die Ivy-Proteinfamilie: Phylogenetische Verteilung.

Eine erschöpfende Suche nach E. coli Ivy-Protein-Homologen wurde unter Verwendung aller öffentlich zugänglichen Sequenzdaten durchgeführt, einschließlich vollständiger bakterieller Genomsequenzen und Daten aus laufenden Sequenzierprojekten aller großen Genomsequenzierungszentren (siehe Material und Methoden). Alle identifizierten Ivy-Homolog-Sequenzen wurden iterativ als Abfragen verwendet, um die Erkennung von evolutionär entfernteren Verwandten zu optimieren. Insgesamt wurden 35 verschiedene Ivy-ähnliche Sequenzen identifiziert (von 100% bis <25% Sequenzidentität mit E. coli K12 Ivy-Protein). Überraschenderweise wurden Ivy-Homologe nur in Mitgliedern der Proteobakterien (Gram-negative Bakterien) identifiziert, und alle von ihnen werden als periplasmatisch vorhergesagt (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). Einerseits mag es logisch erscheinen, dass Ivy-Proteine mit dem Proteoglykan-Anteil (dem Lysozym-Substrat) innerhalb des periplasmatischen Kompartiments kolokalisieren. Andererseits wird angenommen, dass das Proteoglykan-Netzwerk durch die Zellwand der Proteobakterien physisch vor dem Angriff exogener Enzyme abgeschirmt ist und nicht als natürliches Substrat für Lysozym angesehen wird. Das Vorhandensein eines Gens, das für einen Lysozym-Inhibitor kodiert, in Gram-negativen und nicht in Gram-positiven Bakterien ist daher ein Paradoxon. Der phylogenetische Baum der Ivy-Homologe ist in Abb. 3 dargestellt, entsprechend der Standardeinteilung der Proteobacteria (12): alpha, beta, gamma, delta und epsilon. Bis heute ist die Ivy-Proteinfamilie am stärksten in den Gamma- und Beta-Abteilungen vertreten, aber zwei Ivy-Homologe wurden eindeutig in zwei nicht verwandten Arten der Alpha-Abteilung identifiziert: Parococcus denitrificans und Gluconobacter oxydans. Innerhalb der Gamma- und Beta-Divisionen sind Ivy-Homologe sporadisch verteilt. Zum Beispiel sind Ivy-Homologe in allen Enterobacteriales vorhanden, außer in Salmonella, aber auch in allen sequenzierten Pseudomonadaceae. Ähnlich in der Beta-Division: Ivy-Homologe finden sich in allen Burkholderia, werden in einer einzigen Neisseriaceae-Art identifiziert und fehlen in vielen anderen sequenzierten Genomen dieser Division. Diese sporadische Verteilung der Ivy-Proteinfamilie deutet auf eine komplexe zugrundeliegende Evolutionsgeschichte hin, die aus differentiellen Genverlusten über die Kladen hinweg besteht und von Ereignissen horizontaler Transfers überlagert wird, wie eine detaillierte phylogenetische Analyse nahelegt (Abb. 3). Mit Ausnahme der Alphaproteobakterien sind die meisten Spezies, die Ivyc-Orthologe beherbergen, Pathogene oder opportunistische Erreger des Menschen oder anderer Wirbeltiere.

Orthologe vs. paraloge Ivy-Homologe.

Die meisten identifizierten Mitglieder der Ivy-Proteinfamilie, einschließlich der engsten Homologen zu E. coli Ivy, zeigen eine absolute Erhaltung der CKPHDC-Subsequenz (SI Abb. 5a ). Dieses Motiv stimmt genau mit der Lysozym-Inhibitionsschleife überein, die in der 3D-Struktur des HEWL/Ivyc-Komplexes und in unseren funktionellen Studien an Ivyc-Schleifenmutanten identifiziert wurde (siehe oben). Basierend auf diesen Daten haben wir Ivy-Homologe, die diese Schleifen-Sequenz aufweisen, als Bona-fide-Orthologe des E. coli Ivy-Gens klassifiziert (d. h., es wird vorhergesagt, dass sie Lysozym-Inhibitoren sind und in ihren jeweiligen Spezies die gleiche Funktion ausüben). Zwei weitere orthologe Sequenzen enthalten eine nahezu exakte Konservierung der Schleife, wobei der Aspartatrest in der Ivy-Sequenz von Burkordelia cepacia (48 % Identität mit Ivyc) durch einen Asparaginrest und der Lysinrest in der Ivy-Sequenz von Gluconobacter oxydans 621H (26 % Sequenzidentität mit Ivyc) durch einen Argininrest ersetzt wurde. Die Analysen dieser Mutationen im Kontext der 3D-Struktur des Ivyc/HEWL-Komplexes legen nahe, dass beide mit einer korrekten Lysozym/Ivy-Interaktion und damit einer Lysozym-Inhibition vereinbar sein sollten. Die fünf verbleibenden Ivy-Homologe, die nicht-kanonische Schleifensequenzen aufweisen, wurden dann als E. coli Ivy-Paraloge bezeichnet (d. h., es wurde vorhergesagt, dass sie unterschiedliche Funktionen ausführen) (SI Abb. 5b ). Ivy-Paraloge kommen nur bei Arten aus der Gattung Pseudomonas vor: P. aeruginosa, P. syringae, P. putida und P. fluorescens, alle mit verwandten, aber unterschiedlichen CExxDxC-Schleifensequenzen. Darüber hinaus ist P. aeruginosa die einzige Art, die sowohl eine orthologe als auch eine parologe Version von Ivy aufweist. Die orthologe Ivy-Sequenz von P. aeruginosa ist auch diejenige, die der paranalogen Ivy-Sequenz von P. aeruginosa am ähnlichsten ist, was stark darauf hindeutet, dass eine Genduplikation, die zu der nicht-kanonischen Schleife in den Ivy-Paraloga führt, entlang des Zweiges, der zu den Pseudomonadaceae führt, stattgefunden hat. Das Fehlen von Ivy-Homologen in der nahen Gattung Acinetobacter könnte durch nachfolgende Genverluste verursacht worden sein.

Expression und funktionelle Charakterisierung von P. aeruginosa Ivy-Homologen.

Um unsere funktionellen Vorhersagen über die orthologen versus parologen Ivy-Formen zu testen, exprimierten wir (siehe Material und Methoden) das Produkt beider P. aeruginosa Ivy-verwandter Gene. Die beiden Proteine mit den Namen Ivyp1 (ortholog) und Ivyp2 (paralog) wurden gereinigt und auf ihre inhibitorische Aktivität gegen HEWL getestet. Wie aus ihren jeweiligen Schleifensequenzen vorhergesagt, wurde festgestellt, dass das Ivyp1 (CKPHDC)-Protein die Lysozym-Aktivität hemmt, während Ivyp2 (CEKSDC) dies nicht tat. Das Ergebnis der Ivyp1-Inhibition der HEWL-Aktivität ist in SI Abb. 7a dargestellt. Wie bei Ivyc folgt die Hemmung einem „slow tight binding“-Mechanismus mit einem Kiapp {Ivyp1, HEWL} von ≈25 nM.

Struktur von P. aeruginosa Ivyp1 (PDB Code 1UUZ).

Nach dem Nachweis, dass P. aeruginosa Ivyp1 und E. coli Ivy ähnliche Antilysozym-Aktivitäten aufwiesen, bestimmten wir die Struktur des Ivyp1:HEWL-Komplexes, um zu visualisieren, wie die inhibitorische Interaktion trotz der entfernten Ähnlichkeit dieser beiden Ivy-Proteinsequenzen (30 % identische Reste; SI Abb. 5a ) erhalten blieb. Wie erwartet, ähnelt die Struktur von Ivyp1 der Ivyc-Monomerstruktur. Wie jedoch aufgrund der Nicht-Konservierung der an der Ivyc-Dimerbildung beteiligten Reste vorhergesagt wurde, ist P. aeruginosa Ivyp1 ein Monomer.

Trotz dieses signifikanten Unterschieds ist die Interaktion der beiden Ivy-Homologe mit dem Lysozym-Molekül bemerkenswert ähnlich (Abb. 2, SI Abb. 7b , und SI Tabelle 4). Der Cα rmsd zwischen den Ivyp1- und Ivyc-Monomeren beträgt ≈2,8 Å. Wir verglichen dann die Interaktionsflächen in den beiden Komplexen, um die Schlüsselreste zu identifizieren, die für die Robustheit der Ivy-Lysozym-Interaktion verantwortlich sind. In beiden Ivy-Komplexen beinhaltet die Ivy-HEWL-Wechselwirkung die gleiche Menge an Salzbrücken, Wasserstoffbrückenbindungen mit Seitenketten, Seitenketten/Hauptketten und Hauptketten-Wechselwirkungen. Unter den zahlreichen Resten, die an der Interaktion mit Lysozym beteiligt sind, sind jedoch nur drei streng konserviert: Der Histidinrest (H60 in Ivyc, H62 in Ivyp1), der sowohl eine direkte Wasserstoffbrücke (E35-OE1) als auch eine indirekte Wasserstoffbrücke über ein Wassermolekül (D52-OD1) innerhalb des HEWL-Aktivzentrums bildet, ein Aspartatrest (D61 in Ivyc und D63 in Ivyp1) und ein Glutamatrest (E120 in Ivyc und E123 in Ivyp1). Anschließend verglichen wir die Interaktionsbereiche in den beiden Komplexen. Aufgrund des dimeren Zustands des Ivyc-Moleküls ist die Fläche, die bei der Bildung des Ivyc-HEWL-Komplexes vergraben wird, größer (≈1.340 Å2) als für den Ivyp-HEWL-Komplex (≈1.000 Å2). Dieser Unterschied erklärt wahrscheinlich die geringere inhibitorische Aktivität (25-fache Abnahme) von Ivyp1 im Vergleich zu Ivyc.