Der Spielercharakter kann die Questlinien der Erweiterung auf verschiedene Weise beginnen. Stadtwachen können belauscht werden, wenn sie über die Rückkehr der Dawnguard sprechen, oder der Spielercharakter wird direkt von einem orkischen Dawnguard-Mitglied namens Durak angesprochen und gebeten, dem Orden beizutreten, um die wachsende Bedrohung durch Vampire in Skyrim zu bekämpfen. Unabhängig davon, wie es initiiert wird, reist der Spielercharakter nach Fort Dawnguard, das über die Dayspring-Schlucht in der Nähe von Riften erreichbar ist. Sie treffen sich mit dem Kommandanten der Dawnguard, Isran, der die erneute Stärke und Bedrohung durch die Vampire wiederholt und die Zerstörung des Hauptquartiers der Vigilanten von Stendarr in der Pale, der Halle der Vigilanten, und die Tötung von Keeper Carcette als Grund anführt, die Dawnguard zu reformieren und die Vampire auszurotten. Der Spielercharakter erhält eine Armbrust und wird gebeten, zu einer Ruine zu reisen, von der bekannt ist, dass sie von den Vampiren in der Pale erforscht wird, bekannt als Dimhollow Crypt. Bei der Ankunft, nachdem er sich mit den Vampiren, die die Ruine bereits untersuchen, einschließlich ihres Anführers Lokil, auseinandergesetzt hat, entdeckt der Spieler eine Vampirin namens Serana (gesprochen von Laura Bailey), die in einer Statue gefangen ist. Sie ist im Besitz einer Älteren Schriftrolle und informiert den Spieler, dass ihre Familie in einer Behausung vor der Küste von Skyrim, nahe Solitude, namens Schloss Volkihar lebt. Sie bittet den Spielercharakter, sie sicher nach Hause zu eskortieren. Nachdem sie nach Hause zurückgekehrt ist, bietet ihr Vater, der Vampir Lord Harkon, Anführer des mächtigen Clans der Volkihar-Vampire, dem Spieler die Möglichkeit, aus scheinbarer Dankbarkeit für die Sicherheit seiner Tochter ein Vampirlord zu werden und sich dem Clan anzuschließen, oder die Chance, Schloss Volkihar sicher zu verlassen und nach Dawnguard zurückzukehren. Mit dieser Wahl beginnt die Haupthandlung von Dawnguard.
Volkihar-Pfad
Wenn der Spieler das Angebot von Lord Harkon annimmt, beißt der Vampirlord den Spielercharakter. Der Spieler erwacht in einem Raum, vor einem Schrein des daedrischen Fürsten der Herrschaft, Molag Bal. Harkon erklärt, dass Molag Bal als der „Vater der Gattung“ gilt. Vor tausenden von Jahren war Harkon ein König und ein Sterblicher. Er verpfändete seine Seele an Molag Bal und opferte „tausend Unschuldige“ in seinem Namen. Die Daedra gewährten Harkon und seiner Familie Unsterblichkeit, indem sie sie mit Vampirismus befallen haben. Harkon zeigt dem Spieler-Charakter, wie er seine neue Vampir-Lord-Form und seine Kräfte nutzen kann. Der Spieler hat dann die Aufgabe, den Blutstein-Kelch, ein mächtiges Artefakt, das Harkons Sache unterstützen soll, zu holen, ihn mit Wasser aus der Rotwasserhöhle zu füllen und dann das Blut eines mächtigen Vampirs hinzuzufügen. Während der Spielercharakter den Kelch holt, wird er von zwei Volkihar, Stalf und Salonia, angegriffen, die auf Anweisung von Vingalmo und Orthjolf, Harkons Top-Beratern, einen Umsturz planen. Nachdem der Spieler sie getötet hat, fügt er ihr Blut dem Kelch hinzu und kehrt zum Schloss Volkihar zurück.
Nachdem er den Kelch erhalten hat, verbreitet Harkon falsche Gerüchte über den angeblichen Fund einer Älteren Schriftrolle in Skyrim, um zu versuchen, einen Mottenpriester ins Land zu locken. Die Mottenpriester sind ein uralter Orden, der in der Lage ist, die Elder Scrolls zu betrachten und daraus Prophezeiungen zu entschlüsseln. Der Spieler reist zum Versteck des Vorboten südlich der Drachenbrücke und nimmt einen Mottenpriester namens Dexion Evicus gefangen, der von einem orkischen Vampir namens Malkus bezaubert war, bevor er von der Dämmerwache unter der Führung ihres Anführers Vanik getötet wurde. Der Spieler verwandelt den Priester in einen Sklaven, und nachdem er die Schriftrolle gelesen hat, offenbart Evicus den Volkihar, dass sie eine Waffe namens Auriels Bogen sowie zwei weitere Elder Scrolls finden müssen. Eine der Schriftrollen befindet sich in der Dwemer-Ruine von Blackreach und wird als Teil der ursprünglichen Hauptquestlinie zusammen mit der daedrischen Quest für Molag Bals Mit-Daedrischen Prinzen, Hermaeus Mora, gefunden. Die andere wurde von Seranas entfremdeter Mutter, Valerica, mitgenommen, als sie aus der Burg floh. Der Spielercharakter und Serana reisen zu einer Ebene von Oblivion, die als Soul Cairn bekannt ist. Sie finden Valerica und holen sich die letzte Elder Scroll. Bevor sie nach Tamriel zurückkehren, warnt Valerica sie, Harkon aufzuhalten, da er Serana töten will, um die Prophezeiung zu erfüllen. Der Spieler verdient sich auch den Respekt des Drachen Durnehviir, der als Valericas Wächter im Seelenhort fungierte, bevor er vom Spieler im Kampf besiegt wurde, und dem Spieler den Ruf gibt, ihn für eine Weile außerhalb des Seelenhortes zu beschwören.
Der Spielercharakter erfährt aus den Elder Scrolls, dass sich Auriels Bogen in der Höhle von Darkfall befindet. Der Spieler trifft sich mit Gelebor, einem der letzten verbliebenen Schnee-Elfen und einem Ritter-Paladin des Chantry of Auri-El. Er weist den Spieler an, wie er Auriels Bogen zurückholen kann, indem er eine Reihe von Aufgaben erfüllt und den Erzkuraten Vyrthur, Gelebors Bruder, der von den Falmern korrumpiert wurde, besiegt. Der Spielercharakter und Serana konfrontieren Vyrthur im inneren Heiligtum der Chantry und entdecken, dass er sowohl ein Vampir als auch der Schöpfer der Prophezeiung ist und die Sonne blockieren will, um Auri-Els Einfluss in Tamriel zu stören, als Vergeltung dafür, dass der Gott ihm erlaubte, von Vampirismus befallen zu werden.
Nach dem Wiedererlangen des Bogens konfrontieren der Spielercharakter und Serana Lord Harkon in Schloss Volkihar. Sie kämpfen gegen Harkon und töten ihn, wodurch die Bedrohung für Tamriel und Serana beendet wird, und die Mitglieder von Harkons Hofstaat erkennen den Spielercharakter als ihren neuen Herrn und Herrscher der Burg an.
Pfad der Dämmerungswache
Wenn der Spielercharakter Harkons Angebot ablehnt und zur Dämmerungswache zurückkehrt, spielt sich die Handlung fast identisch ab, allerdings aus der Perspektive der Dämmerungswache, wobei der Spieler von Isran beauftragt wird, seine alten Teamkameraden Sorine Jurard und Gunmar zu rekrutieren, um die Zahl der Dämmerungswache wiederherzustellen. Sobald die Dämmerungswache in der Lage ist, ihre Zahl wieder aufzufüllen und sich neu zu formieren, einschließlich der Aufnahme von Florentius Baenius in die Gruppe, macht sich Serana bei der Dämmerungswache bemerkbar, indem sie Informationen über Harkons Plan weitergibt und der Dämmerungswache ihre Unterstützung zusagt, obwohl Isran immer noch seinen Verdacht bezüglich Seranas wahrer Absichten hegt. Nachdem er Malkus getötet und Dexion von der Verzauberung befreit hat, unter die er gestellt wurde, kehrt er nach Fort Dawnguard zurück, um Isran Seranas Älteste Schriftrolle vorzulesen, bevor er ermüdet und Isran ihm Zeit gibt, sich im Fort auszuruhen und zu erholen, während Serana und der Spieler die anderen beiden Älteren Schriftrollen aufspüren. Um den Seelenhort betreten zu können, muss der Spieler von Serana als Vampir blutig gemacht oder teilweise mit einer Seelenfalle versehen werden, um Zugang zu erhalten. Abgesehen von diesen Details folgen die Questlinien einem ähnlichen Pfad wie in Volkihar, aber er weicht während der letzten Story-Mission ab, wenn der Spieler den letzten Angriff der Dawnguard auf Harkon und seinen Hof anführt, um sie zu töten und die Erfüllung der Prophezeiung zu verhindern. Dem Spieler und Serana gelingt es, Harkon in einem klimatischen Showdown zu töten und damit die große Bedrohung durch die Vampire in Skyrim zu beseitigen. Isran bedankt sich bei Serana für ihre Unterstützung und zeigt ihren neu gewonnenen Respekt für sie und bietet dem Spieler an, die Dawnguard weiterhin dabei zu unterstützen, die Vampire auszurotten, die immer noch ein Problem in Skyrim darstellen.