Alle Lanes: beta-Actin-Antikörper – Ladekontrolle (ab8227) bei 1/5000 Verdünnung
Lane 1: HeLa-Ganzzellextrakt
Lane 2: Hefezellextrakt
Lane 3: Mausgehirn-Gewebelysat
- Siehe unsere Liste der verfügbaren Positivkontroll-Lysate, blockierenden Peptide und Positivkontroll-Proteine.
- Sehen Sie sich unsere AbExcel-Sekundärantikörper für außergewöhnliche Western Blots an.
- Sehen Sie sich unsere leicht verständlichen Videoprotokolle an.
Protokolle werden von Abcam „AS-IS“ zur Verfügung gestellt, basierend auf Experimenten in Abcams Laboren unter Verwendung von Abcams Reagenzien und Produkten; Ihre Ergebnisse bei Verwendung von Protokollen außerhalb dieser Bedingungen können abweichen.
Webinar-Transkript
Der Zweck des Western Blotings ist es, Proteine auf einem Gel nach ihrem Molekulargewicht zu trennen. Die Proteine werden dann auf eine Membran übertragen, wo sie mit Antikörpern nachgewiesen werden können. Die Proben werden in einem Probenpuffer, der ein Reduktionsmittel wie z. B. beta-Mercaptoethanol enthält, für fünf bis zehn Minuten auf 95 Grad C erhitzt. Dies führt zu linearisierten Proteinen mit einer negativen Ladung, die proportional zu ihrer Größe ist.
Legen Sie ein Gel in den Elektrophorese-Tank und geben Sie Puffer hinzu, wobei Sie sicherstellen, dass die Oberseiten der Vertiefungen bedeckt sind. Der Acrylamidanteil des verwendeten Gels hängt vom Molekulargewicht des Zielproteins ab. Geben Sie einen Molekulargewichtsmarkt in die erste Lane und laden Sie dann die Proben in die angrenzenden Vertiefungen. Alle Proben, die gleiche Mengen an Protein enthalten. Wenn alle Proben geladen sind, fügen Sie Laufpuffer hinzu und setzen Sie den Deckel auf den Elektrophoresebehälter. Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie die vom Hersteller der Gele empfohlene Spannung im Geltank ein. Sie sollten sehen können, wie Blasen durch den Tank aufsteigen. Lassen Sie das Gel laufen, bis sich die Die-Front ausreichend über das Gel bewegt hat.
Der nächste Schritt ist der Transfer der Proteine vom Gel auf eine Membran. Membranen werden normalerweise aus Nitrocellulose oder PVDF hergestellt. Nehmen Sie das Gel aus dem Tank und lösen Sie es vorsichtig aus seiner Plastikhülle. Schneiden Sie die Vertiefungen und den Gelfuß auf und legen Sie das Gel in Transferpuffer. Bereiten Sie den Transferstapel vor, indem Sie die Membran und das Gel zwischen Filterpapier und Schwämmen einklemmen. Die Membran sollte der positiven Elektrode und das Gel der negativen Elektrode am nächsten sein. Verwenden Sie eine kleine Rolle, um eventuelle Blasen zwischen dem Gel und der Membran zu entfernen. Verschließen Sie das Transfergehäuse und tauchen Sie es in einen Transferbehälter mit Transferpuffer ein. Geben Sie Wasser in die äußere Kammer, um das System kühl zu halten, und setzen Sie den Deckel auf. Schalten Sie die Spannungsversorgung ein, um den Proteintransfer zu beginnen. Zeit und Spannung müssen optimiert werden, daher sollten Sie sich an den Anweisungen des Herstellers orientieren.
Nachdem die Proteine vom Gel auf die Nitrozellulosemembran gewandert sind, kann das gewünschte Protein als Antikörper nachgewiesen werden. Die Membran kann von der Kassette entfernt werden und der Molekulargewichtsmarkt sollte nun sichtbar sein. Falls erforderlich, kann der Transfer der Proteine durch Anfärben der Membran mit Lösung bestätigt werden. Um eine unspezifische Bindung des Antikörpers zu verhindern, muss die Membran blockiert werden. Gießen Sie Blockierungspuffer auf die Membran und schütteln Sie sie vorsichtig auf einer Wippe. Typischerweise geschieht dies mit einer Lösung aus fünfprozentiger Milch oder Rinderserumalbumin, BSA, für zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad. Die Zeit und die Art des Blockierungspuffers sollten optimiert werden, daher sollten Sie das Datenblatt des primären Antikörpers, den Sie verwenden möchten, für Details prüfen.
Nachdem die Membran blockiert ist, entfernen Sie den Blockierungspuffer und fügen den verdünnten primären Antikörper in derselben Lösung hinzu. Inkubieren Sie wie zuvor auf der Wippe. Üblicherweise werden primäre Antikörper eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Die Antikörperkonzentration und die Inkubationszeit müssen optimiert werden. Ziehen Sie das Datenblatt des Antikörpers zu Rate. Gießen Sie den primären Antikörper ab und spülen Sie die Membran zweimal in Waschpuffer. Es folgen ein 15-minütiger Waschvorgang und drei 10-minütige Waschvorgänge auf einer Wippe. Der Waschpuffer ist in der Regel Trys gepufferte Kochsalzlösung (TBS) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1 Prozent Tween 20.
Gießen Sie den Waschpuffer ab und inkubieren Sie die Membran in konjugierendem Sekundärantikörper, der in Blocking-Puffer verdünnt wurde. Normalerweise geschieht dies für eine Stunde bei Raumtemperatur, aber Antikörperkonzentration und Inkubationszeit müssen optimiert werden. Ziehen Sie den Sekundärantikörper ab und waschen Sie die Membran wie zuvor gezeigt.
Es gibt verschiedene Systeme zur Detektion. Wenn die sekundären Antikörper mit einem Enzym konjugieren, inkubieren Sie die Membran vor dem Imaging in dem entsprechenden Substrat. Handelt es sich bei den sekundären Antikörpern um fluoreszierende Counjugate, dann können Sie direkt zum Imaging-Schritt übergehen. Das Imaging kann mit Röntgenfilm oder mit einem digitalen Imaging-System durchgeführt werden. Legen Sie die Membran in eine Imaging-Schale. Legen Sie den Imaging-Tray in das Imaging-System. Die Belichtungszeiten müssen höchstwahrscheinlich optimiert werden, um die Banden der interessierenden Proteine deutlich zu erkennen.