Ein konfokales Mikroskop ist eine Art von 3D-Fluoreszenzmikroskop, bei dem die Auflösung durch die Abweisung von unscharfem Licht erhöht wird. Dies geschieht durch die Verwendung von Nadellöchern mit einem bestimmten Pinhole-Radius und macht es zu einem intrinsischen 3D-Mikroskop: Aufgrund der Fokussierungsnatur des konfokalen Mikroskops ist es besonders geeignet, 3D-Bilder als eine Sammlung von Intensitäten an verschiedenen Punkten des Raumes zu erhalten.
Konfokale Bilder eignen sich sehr gut für die Huygens-Dekonvolution, mit der Huygens Confocal Optical Option, aus zwei Hauptgründen:
1. sie leiden immer noch unter Unschärfe, was bei der Aufnahme von Bead-Bildern deutlich zu sehen ist
2. generell sind konfokale Bilder rauschhafter als Widefield-Bilder, da das Licht vom Objekt durch die Lochblende zurückgeworfen wird.
In konfokalen Mikroskopen ist die Nyquist-Rate etwa halb so hoch wie in Widefield-Mikroskopen.
Wie ein konfokales Mikroskop funktioniert
Biologische Systeme sind typischerweise dreidimensionale Strukturen. Wenn die mit Fluorophoren markierte Probe wie bei der konventionellen Widefield-Mikroskopie mit Anregungslaserlicht durchflutet wird, ist das resultierende Bild in der Regel stark durch unscharfes Fluoreszenzlicht gestört. Dies führt zu einer Unschärfe des Bildes und hat eine deutliche Kontrastverminderung zur Folge. Die konfokale Mikroskopie ist eine Technik, um dieses unerwünschte unscharfe Licht zu reduzieren. Bei dieser Technik wird das Anregungslicht eng in der Probe fokussiert. Das aus dem Fokus austretende Emissionslicht wird mit demselben Objektiv gesammelt, anschließend durch eine kleine Lochblende fokussiert und auf einen Photodetektor gerichtet (Abbildung 1 (a)). Das außerhalb des Fokus liegende Emissionslicht wird durch die Lochblende weitgehend blockiert (Abbildung 1 (b)). Das Ergebnis dieser Methode ist, dass nur das Licht aus dem fokalen Volumen den Detektor erreichen kann. Der Nachteil ist, dass auch Licht von anderen Stellen in der Fokusebene blockiert wird: Konfokale Mikroskopie ist punktweise Anregung und punktweise Detektion. Eine Lösung besteht darin, die Probe Punkt für Punkt zu rastern, um ein vollständiges Bild zu rekonstruieren, in dem nur das Fluoreszenzsignal aus der Fokalebene erfasst wird. Dieses Rasterscanning kann für verschiedene Fokusebenen wiederholt werden, um dicke Proben zu schneiden und ein 3D-Bild der Probe zu rekonstruieren.
Alternativ ist es auch möglich, die Probe mit mehreren Anregungsspots parallel zu scannen, wie z. B. mit einem Spinning-Disk-Mikroskop.
STED ist praktisch eine Erweiterung der Point-Scanning-Konfokalmikroskopie. Der STED-Strahl muss in der Probe fokussiert werden, um die hohe Intensität zu erreichen, die für die stimulierte Emission benötigt wird, während die punktweise Detektion das unscharfe Licht reduziert. Damit STED funktioniert, müssen sich der Anregungsfokus und der STED-Intensitätsnullpunkt des doughnutförmigen Fokus perfekt überlappen. Ein Bild kann dann durch Rasterabtastung der Probe, zum Beispiel mit einem Piezo-Scanningtisch, gewonnen werden. Die Größe der verwendeten Lochblende bestimmt die Tiefenschärfe des Mikroskops.
Konfokale Bilder dekonvolvieren
Die Anwendung der Dekonvolution auf konfokale Bilder erhöht deren Auflösung in x, y und z und befreit sie vom Rauschen. Dadurch lassen sich die Bilder besser visualisieren und analysieren. Der Standardalgorithmus für Konfokal ist Classic Maximum Likelihood Estimation (CMLE) und der Standardwert für SNR ist 20. Wir empfehlen, mit den Standardparametern zu beginnen und andere SNR-Werte zu erforschen, um z. B. die Entfaltungsergebnisse zu optimieren. Sie sollten das SNR nicht als einen Parameter betrachten, der Ihr Originalbild beschreibt, sondern als einen einstellbaren Parameter, der das dekonvolvierte Ergebnis steuert. Die Verwendung eines zu großen SNR-Wertes kann bei der Restaurierung von verrauschten Originalen riskant sein, da Sie damit nur das Rauschen verstärken könnten. Ein verrauschtes konfokales Bild kann SNR-Werte von weniger als 20 haben. Eine weitere Option ist das Testen des Algorithmus Good’s roughness Maximum Likelihood Estimation (GMLE), um die Ergebnisse zu verbessern. Der GMLE eignet sich für verrauschte Bilder, wie konfokal oder STED.
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Remko R.M. Dijkstra, Design and realization of a CW-STED super-resolution microscope setup, Master Thesis , University of Twente, 2012