Les courbes d’étalonnage sont utilisées pour comprendre la réponse instrumentale à un analyte, et pour prédire la concentration de l’analyte dans un échantillon.
Une courbe d’étalonnage est créée en préparant d’abord un ensemble de solutions standard avec des concentrations connues de l’analyte. La réponse de l’instrument est mesurée pour chacune d’entre elles, et tracée en fonction de la concentration de la solution standard. La partie linéaire de ce tracé peut ensuite être utilisée pour prédire la concentration d’un échantillon de l’analyte, en corrélant sa réponse à la concentration.
Cette vidéo présentera les courbes d’étalonnage et leur utilisation, en démontrant la préparation d’un ensemble de normes, suivie de l’analyse d’un échantillon de concentration inconnue.
Un ensemble de solutions standard est utilisé pour préparer la courbe d’étalonnage. Ces solutions sont constituées d’une gamme de concentrations qui englobent la concentration approximative de l’analyte.
Les solutions étalons sont souvent préparées avec une dilution en série. Une dilution en série est réalisée en préparant d’abord une solution mère de l’analyte. La solution mère est ensuite diluée d’une quantité connue, souvent d’un ordre de grandeur. La nouvelle solution est ensuite diluée de la même manière, et ainsi de suite. On obtient ainsi un ensemble de solutions dont les concentrations varient sur plusieurs ordres de grandeur.
La courbe d’étalonnage est un tracé du signal instrumental en fonction de la concentration. Le tracé des étalons doit être linéaire, et peut être ajusté avec l’équation y=mx+b. Les parties non linéaires du tracé doivent être écartées, car ces plages de concentration sont hors de la limite de linéarité.
L’équation de la ligne la mieux ajustée peut alors être utilisée pour déterminer la concentration de l’échantillon, en utilisant le signal instrumental pour établir une corrélation avec la concentration. Les échantillons dont les mesures se situent en dehors de la plage linéaire du tracé doivent être dilués, afin d’être dans la plage linéaire.
La limite de détection de l’instrument, ou la mesure la plus faible qui peut être déterminée statistiquement par rapport au bruit, peut être calculée à partir de la courbe d’étalonnage également. Un échantillon à blanc est mesuré plusieurs fois. La limite de détection est généralement définie comme le signal moyen du blanc plus 3 fois son écart type.
Enfin, la limite de quantification peut également être calculée. La limite de quantification est la plus petite quantité d’analyte qui peut être quantifiée avec précision. Elle est calculée comme étant 10 écarts types au-dessus du signal du blanc.
Maintenant que vous avez appris les bases d’une courbe d’étalonnage, voyons comment en préparer et en utiliser une en laboratoire.
D’abord, préparez une solution mère concentrée de l’étalon. Pesez précisément l’étalon, et transférez-le dans une fiole jaugée. Ajoutez une petite quantité de solvant, et mélangez pour que l’échantillon se dissolve. Ensuite, remplissez jusqu’à la ligne avec le solvant. Il est important d’utiliser le même solvant que l’échantillon.
Pour préparer les étalons, pipeter la quantité requise dans la fiole jaugée. Remplissez ensuite la fiole jusqu’à la ligne avec le solvant, et mélangez.
Continuez à préparer les étalons en pipettant à partir de la solution mère et en diluant. Pour une bonne courbe d’étalonnage, il faut au moins 5 concentrations.
Maintenant, faites passer des échantillons avec l’instrument d’analyse, dans ce cas un spectrophotomètre UV-Vis, afin de déterminer la réponse instrumentale nécessaire pour la courbe d’étalonnage.
Prenez la mesure du premier étalon. Exécutez les étalons dans un ordre aléatoire, au cas où il y aurait des erreurs systématiques. Mesurez chaque étalon 3 à 5 fois pour obtenir une estimation du bruit.
Mesurez le reste des étalons, en répétant les mesures pour chacun. Enregistrez toutes les données.
Finalement, exécutez l’échantillon. Utilisez la même matrice d’échantillon et les mêmes conditions de mesure que celles utilisées pour les normes. Assurez-vous que l’échantillon se situe dans la plage des étalons et la limite de l’instrument.
Pour construire la courbe d’étalonnage, utilisez un programme informatique pour tracer les données sous forme de signal en fonction de la concentration. Utilisez l’écart type des mesures répétées pour chaque point de données pour faire des barres d’erreur.
Supprimez les parties de la courbe qui ne sont pas linéaires, puis effectuez une régression linéaire et déterminez la ligne la mieux ajustée. La sortie doit être une équation de la forme y = m x + b. Une valeur R2 proche de 1 dénote un bon ajustement.
Voici la courbe d’étalonnage du colorant bleu n°1, mesurée à 631 nm. La réponse est linéaire entre 0 et 15 mM.
Calculez la concentration de l’échantillon en utilisant l’équation de la ligne de meilleur ajustement. L’absorbance de l’échantillon était de 0,141, et correspondait à une concentration de 6,02 mM.
Maintenant que vous avez vu comment une courbe d’étalonnage peut être utilisée avec un spectrophotomètre UV-Vis, examinons d’autres applications utiles.
Les courbes d’étalonnage sont souvent utilisées avec des applications d’électrochimie, car le signal de l’électrode doit être étalonné en fonction de la concentration des ions dans la solution. Dans cet exemple, des données ont été recueillies pour une électrode sélective d’ions pour le fluorure.
Les données de concentration doivent être reportées sur l’échelle logarithmique pour obtenir une ligne. Cette courbe d’étalonnage peut être utilisée pour mesurer la concentration de fluorure dans une solution, comme le dentifrice ou l’eau potable.
La chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, est une technique de séparation et d’analyse très utilisée en chimie analytique. La HPLC sépare les composants d’un mélange en fonction du temps nécessaire aux molécules pour parcourir la longueur de la colonne de chromatographie. Ce temps varie en fonction d’une série de propriétés chimiques des molécules.
L’élution des molécules est mesurée à l’aide d’un détecteur, ce qui donne lieu à un chromatogramme. La surface du pic peut être corrélée à la concentration à l’aide d’une courbe d’étalonnage simple d’une gamme de solutions standard, comme dans cet exemple d’ingrédients de soda populaires.
Dans certains cas, lorsque la matrice de la solution interfère avec la mesure du soluté, une courbe d’étalonnage classique peut être inexacte. Dans ces cas, on prépare une courbe d’étalonnage modifiée. Pour cela, une gamme de volumes de solution standard est ajoutée à l’échantillon. Le tracé du signal en fonction de la concentration est créé, où l’ordonnée à l’origine est égale à la concentration originale de la solution d’échantillon. Pour plus de détails sur cette technique, veuillez regarder la vidéo d’éducation scientifique de JoVE, « La méthode d’addition standard ».
Vous venez de regarder l’introduction à la courbe d’étalonnage de JoVE. Vous devriez maintenant comprendre où la courbe d’étalonnage est utilisée, comment la créer et comment l’utiliser pour calculer les concentrations des échantillons.
Comme toujours, merci d’avoir regardé!