Le clonage de l’ADN peut être réalisé spontanément par la cellule à des fins de reproduction. Il s’agit d’une forme de reproduction asexuée où un organisme se divise en fragments, puis chacun de ces fragments se développe en individus matures et adultes qui sont des clones de l’organisme d’origine (Voir fragmentation reproductive).Le clonage de l’ADN peut également être réalisé intentionnellement par les chercheurs en laboratoire. Dans ce cas, la fragmentation de l’ADN est une technique de génétique moléculaire qui permet aux chercheurs d’utiliser la technologie de l’ADN recombinant pour préparer un grand nombre de molécules d’ADN identiques.Pour que le clonage de l’ADN soit complet, il est nécessaire d’obtenir de petites régions discrètes de l’ADN d’un organisme qui constituent des gènes spécifiques. Seules les molécules d’ADN relativement petites peuvent être clonées dans n’importe quel vecteur disponible. Par conséquent, les longues molécules d’ADN qui composent le génome d’un organisme doivent être coupées en fragments qui peuvent être insérés dans l’ADN du vecteur. Deux enzymes facilitent la production de telles molécules d’ADN recombinant :
1. Enzymes de restrictionLes enzymes de restriction sont des endonucléases produites par des bactéries qui reconnaissent généralement de petites séquences de paires de bases (appelées sites de restriction), puis clivent les deux brins d’ADN au niveau de ce site. Un site de restriction est généralement une séquence palindromique, ce qui signifie que la séquence du site de restriction est la même sur chaque brin d’ADN lorsqu’elle est lue dans le sens 5′ vers 3′.Pour chaque enzyme de restriction, les bactéries produisent également une enzyme de modification afin que l’ADN de la bactérie hôte soit protégé du clivage. Cela se fait en modifiant l’ADN de l’hôte au niveau ou à proximité de chaque site de clivage potentiel. L’enzyme de modification ajoute un groupe méthyle à une ou deux bases, et la présence de ce groupe méthyle empêche l’endonucléase de restriction de couper l’ADN.
ADe nombreuses enzymes de restriction effectuent des coupures décalées dans les deux brins d’ADN au niveau de leur site de reconnaissance, ce qui génère des fragments avec une « queue » simple brin qui déborde aux deux extrémités, appelée extrémité collante. Les enzymes de restriction peuvent également effectuer des coupures droites dans les deux brins d’ADN au niveau de leur site de reconnaissance, ce qui génère des extrémités émoussées. 2. ADN ligaseDurant la réplication normale de l’ADN, l’ADN ligase catalyse la jonction (ligature) de bout en bout de courts fragments d’ADN, appelés fragments d’Okazaki. Aux fins du clonage de l’ADN, l’ADN ligase purifiée est utilisée pour joindre de manière covalente les extrémités d’un fragment de restriction et de l’ADN vecteur qui ont des extrémités complémentaires. L’ADN ligase peut ligaturer les extrémités complémentaires collantes et émoussées, mais la ligature des extrémités émoussées est inefficace et nécessite une concentration plus élevée d’ADN et d’ADN ligase que la ligature des extrémités collantes. Pour cette raison, la plupart des enzymes de restriction utilisées dans le clonage de l’ADN effectuent des coupures échelonnées dans les brins d’ADN pour créer des extrémités collantes.
La clé du clonage d’un fragment d’ADN est de le lier à une molécule d’ADN vecteur qui peut se répliquer dans une cellule hôte. Après l’introduction d’une seule molécule d’ADN recombinant (composée d’un vecteur plus un fragment d’ADN inséré) dans une cellule hôte, l’ADN inséré peut être répliqué avec le vecteur, générant ainsi un grand nombre de molécules d’ADN identiques.Le schéma de base peut être résumé comme suit :
Vecteur + fragment d’ADN↓ ADN recombinant↓ Réplication de l’ADN recombinant au sein de la cellule hôte↓ Isolement, séquençage et manipulation du fragment d’ADN purifié
Il existe de nombreuses variantes expérimentales à ce schéma, mais ces étapes sont essentielles au clonage de l’ADN dans un laboratoire.