Comment fonctionne la technique
La microscopie à contraste de phase traduit de petits changements de phase en changements d’amplitude (luminosité), qui sont ensuite vus comme des différences de contraste d’image.
Les spécimens non colorés qui n’absorbent pas la lumière sont connus comme des objets de phase. En effet, ils modifient légèrement la phase de la lumière qui est diffractée par eux ; la lumière est généralement déphasée d’environ ¼ de longueur d’onde par rapport à la lumière de fond. Nos yeux sont incapables de détecter ces légères différences de phase car ils ne peuvent détecter que les variations de fréquence et d’intensité de la lumière.
Le contraste de phase permet de produire des images à fort contraste en augmentant encore la différence de phase de la lumière. C’est cette caractéristique qui permet de séparer la lumière de fond de la lumière diffractée par le spécimen. La différence de phase de la lumière est augmentée en ralentissant (ou en avançant) la lumière de fond d’une longueur d’onde ¼, avec une plaque de phase juste avant le plan image. Lorsque la lumière est focalisée sur le plan image, la lumière diffractée et la lumière de fond provoquent une interférence destructive (ou constructive) qui diminue (ou augmente) la luminosité des zones qui contiennent l’échantillon, par rapport à la lumière de fond.
La lumière d’une lampe tungstène-halogène traverse l’anneau du condenseur de substage avant d’atteindre le spécimen. Cela permet d’éclairer le spécimen par une lumière parallèle qui a été défocalisée.
Une partie de la lumière qui traverse le spécimen ne sera pas diffractée (jaune vif sur l’image). Ces ondes lumineuses forment une image lumineuse sur l’ouverture arrière de l’objectif. Les ondes lumineuses qui sont diffractées par l’échantillon passent le plan diffracté et se concentrent uniquement sur le plan image. Cela permet de séparer la lumière de fond et la lumière diffractée.
La plaque de phase modifie alors la vitesse de la lumière de fond de ¼ de longueur d’onde. Lorsque la lumière est focalisée sur le plan image, la lumière diffractée et la lumière de fond vont provoquer des interférences destructives ou constructives, qui modifient la luminosité des zones qui contiennent l’échantillon par rapport à la lumière de fond. Souvent, l’arrière-plan est également atténué de 60 à 90 % par une bague de filtre gris.
.