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Un microscope confocal est un type de microscope à fluorescence 3D dans lequel la résolution est augmentée en rejetant la lumière hors foyer. Cela se fait en utilisant des sténopés avec un rayon de sténopé spécifique et le fait être un microscope 3D intrinsèque : en raison de la nature focale du microscope confocal, il est spécialement adapté pour obtenir des images 3D comme une collection d’intensités en différents points de l’espace.
Les images confocales sont très bien adaptées à la déconvolution de Huygens, avec l’option optique confocale de Huygens, pour deux raisons principales :
1. elles souffrent encore de flou, ce qui est clairement visible lors de l’enregistrement d’images de perles
2. en général, les images confocales sont plus bruyantes que les images à grand champ, car la lumière de l’objet est rejetée par le sténopé.
Dans les microscopes confocaux, le taux de Nyquist est environ la moitié de celui des microscopes à grand champ.

Comment fonctionne un microscope confocal

Les systèmes biologiques sont généralement des structures tridimensionnelles. Lorsque l’échantillon marqué par un fluorophore est inondé de lumière laser d’excitation comme dans la microscopie conventionnelle à grand champ, l’image résultante est généralement très perturbée par la lumière fluorescente hors foyer. Cela conduit à un flou de l’image et à une diminution significative du contraste. La microscopie confocale est une technique qui permet de réduire cette lumière hors foyer indésirable. Dans cette technique, la lumière d’excitation est étroitement focalisée dans l’échantillon. La lumière d’émission provenant du foyer est collectée par le même objectif, après quoi elle est focalisée à travers un petit trou d’épingle et dirigée vers un photodétecteur (Figure 1 (a)). La lumière d’émission hors foyer sera largement bloquée par le trou d’épingle (Figure 1 (b)). Le résultat de cette méthode est que seule la lumière provenant du volume focal est capable d’atteindre le détecteur. L’inconvénient est que la lumière provenant d’autres endroits du plan focal est également bloquée : la microscopie confocale est une excitation ponctuelle et une détection ponctuelle. Une solution consiste à balayer l’échantillon point par point pour reconstruire une image complète dans laquelle seul le signal fluorescent du plan focal est recueilli. Ce balayage matriciel peut être répété pour différents plans focaux afin de sectionner des échantillons épais et de reconstruire une image 3D de l’échantillon.

Alternativement, il est également possible de balayer l’échantillon avec plusieurs spots d’excitation en parallèle, comme avec un microscope à disque tournant.
STED est pratiquement une extension de la microscopie confocale à balayage ponctuel. Le faisceau STED doit être focalisé dans l’échantillon pour obtenir la haute intensité nécessaire à l’émission stimulée, tandis que la détection ponctuelle réduit la lumière hors foyer. Pour que la STED fonctionne, le centre du foyer d’excitation et le zéro d’intensité STED du foyer en forme de beignet doivent se chevaucher parfaitement. Une image peut alors être obtenue en balayant l’échantillon, par exemple avec une platine piézoélectrique. La taille du sténopé utilisé déterminera la profondeur de foyer du microscope.

Figure 1. Illustration du principe du microscope confocal. Un faisceau collimaté de lumière d’excitation (bleu) est étroitement focalisé dans l’échantillon par un objectif de microscope. L’image de gauche montre que la lumière d’émission résultant de la tache focale sera focalisée à travers le sténopé et que la plupart de la lumière atteindra le détecteur. L’image de droite montre le cas où la lumière émise provient d’un point qui est situé en dehors du volume focal. Cette lumière ne sera pas focalisée par le sténopé et seule une très petite quantité de lumière pourra atteindre le détecteur. Par conséquent, la lumière fluorescente hors foyer est principalement bloquée par le sténopé et donc le signal de fond est considérablement réduit.

Déconvolution des images confocales

Appliquer la déconvolution sur les images confocales augmente leur résolution en x, y et z et les restaure du bruit. Par conséquent, les images seront plus faciles à visualiser et à analyser. L’algorithme par défaut pour la confocale est l’estimation classique du maximum de vraisemblance (CMLE) et la valeur SNR par défaut est 20. Nous suggérons de commencer avec les paramètres par défaut et d’explorer d’autres valeurs SNR, par exemple, pour optimiser les résultats de la déconvolution. Vous ne devez pas considérer le SNR comme un paramètre décrivant votre image originale, mais comme un paramètre ajustable qui contrôle le résultat de la déconvolution. L’utilisation d’une valeur SNR trop élevée peut être risquée lors de la restauration d’originaux bruyants, car vous pourriez simplement renforcer le bruit. Une image confocale bruyante peut avoir des valeurs SNR inférieures à 20. Une autre option consiste à tester l’algorithme d’estimation de la vraisemblance maximale de Good’s roughness (GMLE) pour améliorer les résultats. Le GMLE est adapté aux images bruyantes, comme les images confocales ou STED.

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Remko R.M. Dijkstra, Conception et réalisation d’une configuration de microscope à super-résolution CW-STED, thèse de master , Université de Twente, 2012
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