Cette étude est basée sur un système membranaire cher à K. R. Porter : le réticulum sarcoplasmique (RS) des fibres musculaires striées. Porter a baptisé de manière appropriée l’abondant système membranaire qui entoure étroitement et complètement les myofibrilles dans toutes les cellules musculaires, le SR, en se basant sur sa localisation (sarcoplasmique) et sa structure globale en tant que réseau étendu (réticulum). Dans ses descriptions du RS, initiées en collaboration avec H. S. Bennett (1-3), Porter a reconnu deux aspects importants de ce système membranaire. Le premier est que le RS est simplement une expression spécialisée du réticulum endoplasmique (RE) qui se retrouve dans tous les types de cellules, et le second est que la disposition précise du RS par rapport aux myofibrilles indique son rôle dans un aspect du contrôle de la contractilité. Ces deux idées de Porter sont aujourd’hui pleinement confirmées. On sait que le RS se développe initialement sous forme de RE contenant la variété habituelle de protéines génériques du RE et que, au fur et à mesure que la cellule musculaire se différencie, il s’enrichit considérablement en protéines spécifiques du RS (4, 5). Trois protéines purifiées pour la première fois à partir du RS sont l’ATPase calcique ou la protéine de pompe calcique responsable du pompage du calcium dans la lumière du RS pendant la relaxation (6) ; la calsequestrine, la protéine de liaison au calcium de faible affinité qui augmente considérablement la capacité de calcium de la lumière du RS (7) ; et le récepteur de la ryanodine (RyR), responsable de la libération de calcium pendant l’activation du muscle (voir réf. 8 pour une revue). On a découvert par la suite que tous les types de cellules contiennent des formes et/ou des analogues spécifiques de ces trois protéines qui sont responsables de la gestion du calcium. Dans toutes les cellules, ces protéines ont tendance à être regroupées. Le SR est donc un domaine étendu et spécialisé du RE des cellules musculaires. À l’inverse, toutes les cellules contiennent des domaines spécialisés de type SR, mais en quantité beaucoup plus faible. Certaines cellules non musculaires, comme les cellules de Purkinje du cervelet, possèdent en fait des domaines étendus de type SR contenant des isoformes de RyRs et de calsequestrine spécifiques aux muscles (9, 10).
Comme l’a écrit Porter, dans son style inimitable : spécifique « la relation morphologique précise du réticulum aux myofibrilles…. incite à suggérer que le système est fonctionnellement important dans la contraction musculaire. » La compréhension du rôle spécifique du RS dans le contrôle de la contraction musculaire a été façonnée par des publications critiques dans la période passionnante qui a immédiatement précédé et suivi les descriptions du RS par Porter. Les expériences de stimulation locale d’A. F. Huxley, réalisées à la fin des années 50 et au début des années 60, ont indiqué la présence d’une voie spécifique permettant la propagation de l’événement électrique à l’intérieur de la fibre et ont ainsi fourni un lien crucial entre la dépolarisation de surface et l’activation rapide des myofibrilles situées au centre (voir réf. 11 pour une analyse). L’article fondamental de 1959 de A. Weber a apporté la première preuve que les ions calcium, désormais pleinement reconnus comme des messagers intracellulaires généraux, sont responsables du contrôle de la contraction musculaire (12). S. Ebashi et A. Weber se sont influencés mutuellement à travers les continents en construisant des preuves claires que la capacité de séquestration du calcium du SR explique entièrement la relaxation, tandis que W. Hasselbach a défini précisément l’action de pompage du calcium du SR (voir réf 13 pour une revue).
Ayant suivi de près L. D. Peachey dans le laboratoire de Porter, j’étais pleinement conscient de la recherche, initiée par les résultats d’A. F. Huxely, d’un lien entre le plasmalemme de la fibre musculaire et son intérieur qui permettrait une propagation rapide de l’événement électrique à l’intérieur de la fibre (14). Dans leur article de 1957 (3), Porter et Palade avaient décrit une unité structurelle répétitive, la triade, qui est située en relation précise avec les bandes des myofibrilles : soit en face de la ligne Z, soit en face de la jonction A-I. La triade est composée de 2 SRP et d’un SRP. La triade est composée de 2 citernes SR faisant face à un tubule central. La localisation de la triade (3) et de son tubule central (15-17) coïncide avec les sites où se produit la propagation vers l’intérieur des contractions résultant d’une dépolarisation locale (11). En utilisant des coupes sérielles minutieuses, Andersson-Cedergren (18) a démontré que les éléments centraux de la triade forment un réseau continu à travers les fibres musculaires, d’où le nom de tubules transversaux (T) pour ces composants de la triade. Les yeux des microscopistes électroniques étaient donc rivés sur les tubules T, et j’étais prêt pour la découverte qui m’attendait vers la fin de ma période de formation postdoctorale dans le laboratoire de Porter (1963). J’examinais de fines coupes de muscles squelettiques de guppies qui avaient été élevés dans les bassins d’Elisabeth Porter et j’ai soudainement vu des exemples répétés de bouches grandes ouvertes de tubules T au bord de la fibre. Il était facile d’attirer l’attention de Porter : Je suis entré dans son laboratoire à 22h00-11h00, la fin habituelle de sa journée de travail, quand il pouvait se détendre, et je lui ai montré mes négatifs. L’intérêt de Porter a été immédiatement éveillé. Mes photos n’étaient pas à la hauteur de ses exigences, alors il a pris un de mes blocs, a personnellement coupé de fines sections et a pris une série de micrographies, chacune étant une œuvre d’art (Fig. 1A). Les micrographies de Porter ont constitué la plupart des illustrations de la publication finale montrant que les tubules T ont les caractéristiques essentielles nécessaires à leur rôle dans la propagation de la dépolarisation de la membrane de surface à l’intérieur de la fibre (19, voir aussi Fig. 1B). La continuité de la lumière des tubules T avec les espaces extracellulaires a également été confirmée la même année par la pénétration de traceurs de l’espace extracellulaire (20, 21) et d’un colorant fluorescent (22). La continuité des tubules T avec la membrane de surface est à la base de la grande capacité de la membrane de surface des fibres musculaires.
Les domaines fonctionnels du SR sont associés soit à la membrane de surface, soit aux tubules T (figures 1C, G), formant avec eux des jonctions bien définies appelées unités de libération du calcium (voir 23, 24 pour des revues). Pendant le couplage excitation-contraction (e-c), les membranes extérieures sont initialement dépolarisées, et immédiatement après le SR libère du calcium dans les espaces myofibrillaires. La question structurelle qui se pose alors est la suivante : quelle est la relation entre le SR et les membranes extérieures au niveau de ces sites de jonction spécialisés qui permet de traduire l’événement électrique en libération de calcium par le SR pendant l’activation musculaire ? En avançant dans le temps de ∼25 ans, la question structurelle moderne concernant cette étape du couplage e-c est : quelle est la relation spatiale entre les protéines du SR et des membranes extérieures dans les unités de libération du calcium, et que peut-on déduire de cette association ? Quatre protéines du SR jonctionnel sont bien identifiées : les récepteurs de la ryanodine (RyRs), ou canaux de libération du calcium du SR (8) ; la calsequestrine (7, 25) ; la triadine (26) ; et la junctine (27). Les RyRs sont des canaux calciques homotétramériques constitués de 4 sous-unités identiques avec un large domaine cytoplasmique et une masse combinée de ∼2 000 kDa, qui, lorsqu’ils sont ouverts, permettent une fuite rapide du calcium SR dans les espaces myofibrillaires. Les domaines cytoplasmiques des RyRs sont visibles au microscope électronique comme des pieds qui relient la surface jonctionnelle des SR aux membranes extérieures (figure 1C, D). Les RyRs sont donc stratégiquement situés pour interagir avec la membrane de surface. La calsequestrine est une protéine luminale des citernes des SR, située à proximité des domaines de jonction des SR (Figs. 1B, C). Sa fonction est d’augmenter la capacité totale de calcium de la lumière du RS, tout en maintenant une concentration de calcium libre relativement élevée, permettant ainsi un large gradient de concentration de calcium ionique entre la lumière du RS et les myofibrilles. La triadine est probablement la protéine qui lie la calsequestrine à la surface du RS, la maintenant à proximité des RyRs, et la junctine peut également jouer un rôle similaire. L’une ou l’autre de ces deux dernières protéines, ou d’autres encore à identifier, est responsable du maintien de la calsequestrine immobilisée à proximité des canaux de libération du calcium. Une protéine membranaire de surface est située au niveau des domaines de jonction des membranes extérieures participant aux unités de libération du calcium (23) : le canal calcique de type L, également appelé récepteur de la dihydropyridine (DHPR). Les DHPR agissent comme des capteurs de tension ainsi que comme des canaux calciques, et leur action est nécessaire pour initier la libération de calcium à partir du SR (28, 29).
Dans le muscle squelettique, les DHPR sont regroupés en tétrades, ou groupes de 4 composants situés aux coins de petits carrés (figures 1E, I). Les tétrades de DHPR forment des réseaux ordonnés qui font face aux réseaux ordonnés des pieds SR de telle sorte que chacun des 4 DHPR composant la tétrade semble être lié à une sous-unité d’un pied sous-jacent (30, 31). Cette relation structurelle directe entre les deux principales protéines de l’unité de libération du calcium contribue à étayer l’hypothèse dite » mécanique » du couplage e-c, selon laquelle des capteurs de tension dans la membrane du tubule T (dont on a montré par la suite qu’il s’agissait des DHPR) détectent la dépolarisation et affectent la libération du calcium par le SR par une interaction moléculaire directe (32). L’une des observations structurelles déroutantes concernant la relation DHPR-RyR est que les tétrades sont associées à des pieds alternés (Fig. 1 M), laissant un ensemble de pieds orphelins (ou RyRs) qui ne sont pas directement liés aux DHPR. Des travaux comparatifs sur une variété de muscles in vivo et in vitro indiquent que la disposition alternée est la règle pour le muscle squelettique, et qu’elle ne dépend pas de la présence de 2 types d’isoformes de RyR.
L’exploration récente de la base moléculaire et développementale de la relation DHPR-RyR est le travail de deux boursiers postdoctoraux de mon laboratoire (Drs Hiroaki Takekura et Feliciano Protasi) et implique des collaborations avec les Drs P. D. Allen, K. G. Beam, B. E. Flucher et H. Takeshima. La première question que nous avons examinée est de savoir comment la disposition alternée des tétrades est produite pendant le développement des jonctions. Cette question a été explorée en collaboration avec le Dr B. E. Flucher en utilisant des cellules d’origine musculaire squelettique dans la lignée cellulaire BC3H1, qui développent des amas co-localisés de DHPR, de triadine et de RyRs à la périphérie des cellules (33). Les sections minces et les fractures de congélation de ces cellules montrent des unités de libération de calcium bien différenciées contenant des réseaux ordonnés étendus de pieds et de tétrades. Les tétrades sont disposées différemment. De nombreuses jonctions présentent des tétrades avec des éléments manquants, et comme nous les trouvons aussi bien au début qu’à la fin de la culture, nous supposons que beaucoup représentent des jonctions en cours de formation. De façon intéressante, même lorsqu’ils sont tout à fait incomplets, les réseaux de tétrades ont la disposition alternée par rapport aux réseaux de pieds, ce qui indique que cette relation est intrinsèque aux interactions entre les 2 protéines.
La deuxième question est de savoir si le regroupement des DHPR en tétrades est propre au muscle squelettique ou est présent dans des muscles qui semblent avoir une base différente pour le couplage e-c. Le muscle cardiaque contient des isoformes de RyRs et de DHPRs différentes de celles du muscle squelettique, et elles diffèrent fonctionnellement en ce que la perméation du calcium à travers les DHPRs semble être une condition nécessaire au couplage e-c (34, 35). Les DHPR et les RyR du muscle cardiaque sont situés sur des sites qui semblent co-localisés au niveau du microscope optique (Fig. 1F), tout comme dans le muscle squelettique, et cette juxtaposition est réalisée tôt dans la différenciation de l’appareil de couplage e-c (36-38). La lyophilisation montre cependant que la disposition des DHPR dans le muscle cardiaque est différente de celle du muscle squelettique (comparer les figures 1I, K). Les DHPR sont à proximité des pieds mais ne semblent pas être directement liés à eux (Fig. 1N), de sorte que leur interaction peut être indirecte, via un transmetteur (par exemple, le calcium).
Les informations ci-dessus sont directement pertinentes pour comprendre 2 modèles de souris pour l’étude du couplage e-c. Dans un modèle, la sous-unité principale (α1) des DHPR squelettiques est absente. Les muscles ne se contractent pas en raison d’un manque de couplage e-c et se développent mal (d’où le terme dysgénique). Cependant, des triades contenant des réseaux de pieds sont formées, indiquant que la présence de RyRs n’est pas nécessaire pour la formation de jonctions SR-surface. Les grappes de DH-PRs (détectées par immunomarquage) et les tétrades de DHPR (détectées par lyophilisation) sont absentes dans les cellules musculaires dysgéniques, mais elles sont restaurées par transfection de myotubes dysgéniques cultivés avec un ADNc pour le DHPR, ce qui démontre que les tétrades sont composées de DHPRs (31, 39, 40). L’autre modèle est une mutation nulle ciblée du RyR de type squelettique, qui entraîne également un blocage du couplage e-c. Les fibres musculaires dépourvues de RyR, qui ne sont pas des tétrades, ne sont pas non plus des tétrades. Les fibres musculaires dépourvues de RyR, de manière inattendue, forment des triades (41) (Fig. 1H). Les triades n’ont pas de pieds, d’où le terme de dyspédie, mais semblent normales en coupes fines. Une lignée cellulaire (1B5) développée à partir d’une mutation dyspédique manque également de couplage e-c. En utilisant ces cellules, nous avons montré que malgré l’absence de pieds, les jonctions SR-surface dyspédiques sont formées et contiennent de la triadine et des DH-PRs (42). Cependant, lors de la lyophilisation, les amas de DHPRs situés au niveau des jonctions dyspédiques ne s’agrègent pas en tétrades (Fig. 1L). L’expression de l’ADNc codant pour le RyR de type 1 du muscle squelettique dans les cellules 1B5 entraîne la formation de taches de RyR situées à la périphérie (Fig. 1P) et le regroupement des DHPR en tétrades (Fig. 1Q). Par conséquent, les DHPR n’ont pas besoin de la présence de RyRs pour se regrouper aux sites de jonction SR-surface, mais ils ont besoin d’une interaction avec les RyRs squelettiques afin de former des tétrades. Cela confirme également indirectement qu’un lien entre les RyR et les DHPR existe dans les fibres musculaires squelettiques. A l’inverse, l’absence de tétrades dans le muscle cardiaque indique que soit un lien RyR-DHPR n’est pas présent, soit que ce lien est différent de celui du muscle squelettique. Tant la présence de la liaison RyR-DHPR que son absence ou sa différence ont des implications fonctionnelles profondes pour le couplage e-c. K. R. Porter aurait approuvé ces développements dans notre compréhension du SR, car ils sont basés sur des relations structure-fonction précisément définissables.