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2.1. Propriétés de croissance de S. boulardii

Pour caractériser davantage cette levure, ses propriétés de croissance à différentes températures sont comparées à d’autres souches de levures diploïdes (toutes les souches de levures utilisées sont résumées dans le tableau 1). S. boulardii (je garderai ce nom dans le texte même s’il s’agit d’une souche de S. cerevisiae) se développe bien sur un milieu riche à 30°C ainsi qu’à 37°C mais pas à 40°C (Figure 1A). La croissance à 37°C, même si elle n’est pas idéale, n’est pas rare pour les souches de levure telles que la souche diploïde BY4743 (un dérivé de S288C) mais par opposition à la souche diploïde RH2585/2586 (un dérivé de Σ1278b) qui ne croît pratiquement pas à 37°C (Figure 1A). En ce sens, la croissance à 37°C n’est pas une propriété particulière et unique de S. boulardii. Elle reflète probablement plutôt son accommodation aux climats chauds tels que ceux que l’on retrouve souvent en Indochine.

Une autre propriété étudiée est la capacité potentielle de S. boulardii à former des filaments. À cette fin, elle a été cultivée sur des plaques SLAD qui ne portent que des concentrations limitantes de sulfate d’ammonium (50 μM, environ 1000× moins que le milieu minimal SD conventionnel). Comme observé au microscope, la souche diploïde RH2585/2586 présente clairement des propriétés filamenteuses dans ces conditions limitant l’ammonium (Figure 1B) . La délétion du gène FLO8 codant pour un facteur de transcription requis pour la filamentation et l’adhésion a complètement aboli ses propriétés filamenteuses. Flo8 est nécessaire pour exprimer, par exemple, Flo11, une glycoprotéine de surface cellulaire. Contrairement à RH2585/2586, S. boulardii n’a pratiquement pas montré de propriétés de filamentation. Il est intéressant de noter que le séquençage du gène FLO8 de S. boulardii amplifié par PCR a indiqué qu’il ne porte pas de codon stop prématuré (non montré) que l’on trouve dans les souches de levure non filamenteuses comme celles dérivées de S288C. Ainsi, d’autres gènes en amont ou en aval nécessaires à la filamentation sont probablement dysfonctionnels chez S. boulardii. Son absence de filamentation explique probablement sa faible toxicité et son absence de capacité d’établissement dans le tractus gastro-intestinal qui, sinon, pourrait la rendre plus persistante et donc plus problématique pour les applications médicales.

Une autre question intéressante était d’induire la méiose et la sporulation chez S. boulardii afin d’obtenir une descendance haploïde. Pour cela, des cellules diploïdes ont été incubées dans un milieu liquide avec de l’azote limitant et une concentration très élevée d’acétate de potassium comme source de carbone (pauvre) . Malgré plusieurs tentatives, aucune formation de tétrade n’a été observée. À cet égard, S. boulardii présente des propriétés similaires à celles de RH2585/2586 (la diploïde filamenteuse utilisée dans ce travail) qui ne forme pas de tétrades lors du traitement dans les conditions décrites. Afin d’induire la méiose et la sporulation, un double knockout de RME1 (Regulator of Meiosis 1) dans S. boulardii a été produit. RME1 est un régulateur négatif de la méiose qui empêche l’expression des protéines nécessaires à la méiose comme IME1 (Inducer of Meiosis 1) et favorise la mitose . Le dérivé de S. boulardii ∆∆rme1 n’a pas montré de différences phénotypiques par rapport à la souche parentale de type sauvage en termes de température de croissance (Figure 1A). Malheureusement, aucune tétrade n’a été obtenue à partir de cette souche knockout non plus. J’en conclus que S. boulardii ne subit pas la méiose et la formation de tétrades haploïdes, du moins dans les conditions de laboratoire utilisées ici.

Comme le montre la figure 1C, S. boulardii ne porte pas de marqueurs auxotrophes, car il se développe bien sur un milieu minimal (SD) dépourvu d’acides aminés ou de composants d’acides nucléiques tels que l’adénine ou l’uracile. Des gènes marqueurs auxotrophes ont pu être facilement obtenus en délétant les gènes ADE2 (biosynthèse de l’adénine) ou HIS3 (biosynthèse de l’histidine) (Figure 1C). Ces délétions ont été obtenues en introduisant des gènes marqueurs auxotrophes dominants qui confèrent une résistance aux antibiotiques kanamycine/G418 ou nourseothricine. La délétion d’une seule copie du gène ADE2 ou HIS3 permettait encore la croissance sur des plaques de milieu minimal (non montré), ce qui indique le caractère clairement diploïde de cette levure. Seule la double délétion des deux copies du gène HIS3 ou ADE2 (qui l’a rendue résistante à la kanamycine/G418 et à la nourseothricine ; figure 1C) a rendu cette souche de levure auxotrophe pour l’histidine ou l’adénine. L’auxotrophie pour l’histidine nouvellement acquise a été utilisée dans une expérience ultérieure pour la transformer avec des plasmides de levure portant HIS3 comme gène marqueur sélectionnable (voir texte suivant).