Toutes les voies : anticorps beta Actin – contrôle de charge (ab8227) à une dilution de 1/5000
Lane 1 : extrait de cellules entières de HeLa
Lane 2 : Extrait de cellules de levure
Lane 3 : Lysat de tissu cérébral de souris
- Voir notre liste de lysats de contrôle positif, de peptides de blocage et de protéines de contrôle positif disponibles.
- Voir les anticorps secondaires AbExcel pour des western blots exceptionnels.
- Voir nos protocoles vidéo faciles à suivre.
Les protocoles sont fournis par Abcam « AS-IS » sur la base d’expérimentations dans les laboratoires d’Abcam en utilisant les réactifs et produits d’Abcam ; vos résultats d’utilisation des protocoles en dehors de ces conditions peuvent varier.
Transcription du webinaire
Le but du western blotting est de séparer les protéines sur un gel en fonction de leur poids moléculaire. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane où elles peuvent être détectées à l’aide d’anticorps. Chauffez les échantillons et 95 degrés C pendant cinq à dix minutes dans un tampon d’échantillon contenant un agent réducteur tel que le bêta-mercaptoéthanol. Cela permet d’obtenir des protéines linéarisées avec une charge négative proportionnelle à leur taille.
Placer un gel dans la cuve d’électrophorèse et ajouter du tampon en veillant à couvrir le haut des puits. Le pourcentage d’acrylamide du gel utilisé dépend de la masse moléculaire de la protéine cible. Noyer un marché de poids moléculaire dans la première voie puis charger les échantillons dans les puits adjacents. Tous les échantillons qui contenaient des quantités égales de protéines. Une fois que tous les échantillons sont chargés, ajoutez du tampon de fonctionnement, placez le couvercle sur la cuve d’électrophorèse. Allumez l’alimentation électrique et réglez la tension recommandée par le fabricant des gels dans la cuve à gel. Vous devriez être en mesure de voir des bulles s’élever dans le réservoir. Faites tourner le gel jusqu’à ce que le front de la filière se soit suffisamment déplacé vers le bas du gel.
L’étape suivante consiste à transférer les protéines du gel sur une membrane. Les membranes sont généralement fabriquées à partir de nitrocellulose ou de PVDF. Retirez le gel de la cuve et dégagez-le soigneusement de son étui en plastique. Découpez les puits et le pied du gel et placez le gel dans un tampon de transfert. Préparez la pile de transfert en prenant en sandwich la membrane et le gel entre du papier filtre et des éponges. La membrane doit être calée sur l’électrode positive et le gel le plus proche de l’électrode négative. Utilisez un petit rouleau pour éliminer toutes les bulles entre le gel et la membrane. Fermez le boîtier de transfert et immergez-le dans un réservoir de transfert contenant un tampon de transfert. Ajoutez de l’eau dans la chambre extérieure pour maintenir le système au frais et mettez le couvercle. Allumez l’alimentation électrique pour commencer le transfert des protéines. Le temps et la tension nécessitent une optimisation, alors vérifiez les instructions du fabricant pour vous guider.
Maintenant que les protéines ont migré du gel sur la membrane de nitrocellulose, la protéine d’intérêt peut être détectée sous forme d’anticorps. La membrane peut être retirée de la cassette et le marché de poids moléculaire devrait maintenant être visible. Si nécessaire, le transfert des protéines peut être confirmé en colorant la membrane avec une solution. Pour éviter une liaison non spécifique de l’anticorps, la membrane doit être bloquée. Versez le tampon de blocage sur la membrane et agitez doucement sur une bascule. En général, on utilise une solution de lait à 5 % ou d’albumine de sérum bovin (BSA) pendant deux heures à température ambiante ou toute la nuit à 4 degrés. Le temps et le type de tampon de blocage doivent être optimisés, donc consultez la fiche technique de l’anticorps primaire que vous avez l’intention d’utiliser pour plus de détails.
Après le blocage de la membrane, retirez le tampon de blocage et ajoutez l’anticorps primaire dilué dans la même solution. Incubez sur la bascule comme précédemment. Généralement, les incubations d’anticorps primaires sont d’une heure à température ambiante ou d’une nuit à quatre degrés C. La concentration d’anticorps et le temps d’incubation devront être optimisés. Se référer à la fiche technique de l’anticorps pour obtenir des conseils. Retirer l’anticorps primaire et rincer la membrane deux fois dans le tampon de lavage. Faites suivre d’un lavage de 15 minutes et de trois lavages de 10 minutes sur une bascule. Le tampon de lavage est généralement du Trys buffered saline, TBS, ou du phosphate buffered, saline, PBS, avec 0,1 pour cent de tween 20.
Verse le tampon de lavage et incube la membrane dans un anticorps secondaire conjugué qui a été dilué dans un tampon de blocage. Habituellement, cela se fait pendant une heure à température ambiante, mais la concentration en anticorps et le temps d’incubation devront être optimisés. Retirer l’anticorps secondaire et laver la membrane a montré précédemment.
Il existe plusieurs systèmes différents pour la détection. Si les anticorps secondaires se conjuguent en une enzyme, incuber la membrane dans le substrat approprié avant l’imagerie. Si les anticorps secondaires sont des counjugués fluorescents, alors vous pouvez passer directement à l’étape d’imagerie. L’imagerie peut être réalisée avec un film à rayons X ou avec un système d’imagerie numérique. Placez la membrane dans un plateau d’imagerie. Placez le plateau d’imagerie dans le système d’imagerie. Les temps d’exposition devront très probablement être optimisés afin de détecter clairement les bandes relatives aux protéines d’intérêt.
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