Après sa formation à Yale, où elle a étudié avec Earle R. Gister et joué dans plusieurs pièces de Shakespeare, Sanaa Lathan a été acclamée à la fois off-Broadway et sur la scène de Los Angeles. Encouragée par son père à faire de Los Angeles sa base professionnelle, elle trouve ses premiers rôles à la télévision dans des épisodes de séries telles que In the House, Family Matters, NYPD Blue et Moesha.
En 1998, Lathan obtient une certaine reconnaissance avec son rôle de mère du personnage-titre de Wesley Snipes dans Blade. Elle a enchaîné l’année suivante avec un rôle dans Life avec Martin Lawrence et Eddie Murphy et des tours consécutifs dans The Best Man et The Wood. The Best Man était un film comique d’ensemble, avec Taye Diggs, Nia Long, Harold Perrineau Jr. et Morris Chestnut. The Best Man est devenu l’un des dix films afro-américains les plus rentables de l’histoire et Nia Long a été nommée au NAACP Image Award pour sa performance. The Wood, un autre film d’ensemble mettant en vedette Diggs et Omar Epps, lui confie le rôle de l’intérêt amoureux d’Epps.
Lathan et Epps ont été réunis à l’écran dans Love & Basketball, jouant cette fois un couple aussi passionné par le basket-ball que par l’autre. Sa performance dans Love & Basketball lui vaut le NAACP Image Award 2001 de la meilleure actrice dans un film, ainsi qu’une nomination à l’Independent Spirit Award de la meilleure actrice et un BET Award. En 2000, Lathan est apparue dans la production Off-Broadway de The Vagina Monologues aux côtés de Teri Garr et Julianna Margulies.
En 2001, Lathan a obtenu des éloges supplémentaires pour son travail dans le film comique multiculturel Catfish in Black Bean Sauce. Vient ensuite sa deuxième collaboration avec Prince-Bythewood : Disappearing Acts ; ce film est basé sur un roman de Terry McMillan. Dans ce film de HBO, Lathan joue le rôle d’une chanteuse/compositrice en herbe amoureuse d’un charpentier, joué par son covedette de Blade, Wesley Snipes. Pour son travail dans le film, Lathan a reçu le prix Essence de la meilleure actrice. Cette année-là, le magazine Ebony l’a désignée comme l’une des 55 plus belles personnes et le magazine Essence et Black Entertainment Television lui ont rendu hommage.En 2002, Lathan a joué dans la comédie romantique Brown Sugar, aux côtés de Diggs, Queen Latifah et Mos Def. La performance de Lathan lui a valu une nomination au NAACP Image Award pour la meilleure actrice dans un film. Le film a également reçu une nomination au NAACP Image Award pour le meilleur film.
En 2004, Lathan a joué à Broadway dans A Raisin in the Sun avec Sean Combs, Audra McDonald et Phylicia Rashad. Lathan a reçu une nomination au Tony Award de la meilleure performance d’une actrice vedette pour son interprétation de Beneatha Younger. Plusieurs années plus tard, Lathan reprend le rôle dans une production d’ABC Network de A Raisin in the Sun.
En 2003, elle partage l’affiche avec Denzel Washington dans Out of Time. L’année suivante, elle obtient le rôle principal dans Alien vs Predator. Le film a été un grand succès, rapportant plus de 171 millions de dollars dans le monde.
En 2006, elle partage l’affiche avec Simon Baker dans Something New, une comédie romantique ; elle incarne Michelle Landau, la femme beaucoup plus jeune d’un homme d’affaires texan (Larry Hagman) lors de la quatrième saison de la série télévisée Nip/Tuck ; et en 2008, elle joue le rôle d’Andrea dans The Family That Preys de Tyler Perry. Le film met également en vedette Alfre Woodard et Kathy Bates ; il est sorti aux États-Unis le 12 septembre 2008. Dans une interview accordée à NPR, Lathan a déclaré que le scénario adoptait une approche nouvelle pour raconter une histoire d’amour interraciale, en décrivant le conflit interne auquel sont confrontées certaines femmes afro-américaines lorsqu’il s’agit de faire des rencontres interraciales. « J’ai l’impression qu’avec les femmes noires, d’une certaine manière, il a été plus difficile pour nous d’y aller, simplement en termes de culture. Je sais qu’il y a cette statistique qui dit que 13 % des hommes noirs ont des relations interraciales. Et ne me citez pas, mais c’est environ quatre ou trois pour cent des femmes noires qui sont dans des relations interraciales ; et je pense que cela en dit long sur, vous savez, soit la loyauté des femmes noires envers son homme noir, soit sa culpabilité à sortir de la race. »
En 2009, Lathan a partagé l’affiche avec Matthew Broderick dans le drame Wonderful World. De 2009 à 2013, elle a incarné le personnage de Donna Tubbs dans la série The Cleveland Show. En 2011, elle a joué dans le thriller Contagion de Steven Soderbergh aux côtés de Matt Damon, Jude Law, Marion Cotillard, Kate Winslet, Gwyneth Paltrow, Bryan Cranston et Laurence Fishburne. En 2011, Lathan a joué avec Anthony Mackie et Forest Whitaker dans Repentance, un thriller psychologique réalisé par Phillipe Caland.Lathan a joué le rôle de la régulière de la série Mona Fredricks dans la deuxième saison de la série originale Boss de Starz, avec Kelsey Grammer.
En 2013, Lathan a repris son rôle dans la suite de The Best Man′s, The Best Man Holiday. En 2016, elle fait partie de l’ensemble de la suite de Now You See Me intitulée Now You See Me 2, qui a été un succès au box-office, et elle est au casting du film de science-fiction Approaching the Unknown. En 2017, Lathan est revenue à la télévision dans un rôle principal dans la série Shots Fired, et est également apparue dans le film American Assassin. Lathan a ensuite été ajoutée au casting principal de The Affair, apparaissant dans ses quatrième et cinquième saisons, et a joué dans le film Netflix Nappily Ever After.