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Résultats

Structure globale de la protéine Ivy d’E. coli .

La protéine codée par le gène ykfE a été exprimée et purifiée dans le cadre d’un projet de génomique structurelle ciblant systématiquement les gènes d’E. coli de fonction inconnue. La protéine YkfE a été découverte par hasard pour copurifier, puis cocristalliser avec HEWL utilisé dans le protocole de perturbation bactérienne de routine. La protéine YkfE a ensuite été caractérisée comme un inhibiteur puissant et spécifique du lysozyme de type C (7), et le nom du gène a été changé en Ivy (inhibiteur du lysozyme des vertébrés) pour refléter cette propriété. Des structures cristallines à haute résolution ont été obtenues pour E. coli Ivy (Ivyc), à la fois isolée et en complexe avec le lysozyme .

Description de la structure.

Nous avons précédemment démontré par filtration sur gel et études de fluorescence que l’homodimère périplasmique d’Ivyc est l’unité physiologiquement active, avec un K d de dimérisation de l’ordre de 10-9 M (7). La protéine Ivyc a été cristallisée sous forme de dimère. L’unité asymétrique du cristal contient trois molécules correspondant à un dimère non cristallographique et à un monomère. En appliquant la symétrie cristallographique, ce monomère reconstitue le dimère physiologique. Chaque monomère est constitué d’un feuillet β central composé de cinq brins β antiparallèles flanqués, du côté convexe, de deux courtes hélices (α1, α2 ; six et huit résidus, respectivement) et, du côté concave, d’une hélice amphipatique (α4 ; 11 résidus) (figure 1). Nous avons cherché des homologues structurels de ce domaine en utilisant le programme DALI (8). La meilleure correspondance structurelle dans le PDB est l’histone acétyltransférase 306-aa (code PDB 1BOB) de la levure (Z = 5.2), avec seulement 9% de résidus identiques sur 89 acides aminés et un rmsd de 4.0 Å. Cependant, la topologie des deux structures est nettement différente, faisant ainsi de la structure d’Ivy un nouveau pli. La structure du dimère présente un pliage en fer à cheval centré sur les deux hélices amphipatiques antiparallèles (α4) (Fig. 1 b). Dans le cristal, il y a une surface enterrée de 1 605 Å2 entre les deux monomères reliés par l’axe cristallographique du double pli (monomère A) et une surface enterrée de 1 432 Å2 entre les deux monomères reliés par l’axe non cristallographique du double pli (monomères B et C). Le rmsd entre les trois monomères varie de 0,547 Å (B/C) à 0,865 Å sur 122 résidus (A/B) d’après la superposition Cα. La structure révèle que le dimère implique des interactions entre les squelettes et les chaînes latérales de résidus tous rassemblés dans la partie C-terminale de la molécule dans le brin β6 et les hélices α4 et α5 (figure 2 b). Ces résidus sont conservés dans diverses souches d’E. coli, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae et les séquences d’homologues de Burkholderia cepacia, ce qui suggère que la protéine Ivy est un dimère fonctionnel dans ces bactéries et probablement monomérique dans les autres bactéries contenant Ivy.

Mécanisme d’inhibition du lysozyme : La structure du complexe Ivyc-HEWL (code PDB 1GPQ).

L’unité asymétrique du cristal contient un homodimère non cristallographique d’Ivyc en complexe avec deux molécules de HEWL. Il existe deux types d’interactions Ivyc/HEWL : l’interaction principale impliquant une surface enterrée de 969-Å2 entre un monomère Ivyc et une molécule HEWL, et une interaction secondaire impliquant une surface enterrée de 552-Å2 entre le second monomère Ivyc et la même molécule HEWL, créant ainsi une surface enterrée de 1 340-Å2 entre l’homodimère Ivyc et la première molécule HEWL (Fig. 2 a). Pour le second monomère HEWL, la surface enfouie est de 1 043 Å2 pour l’interaction principale et de 623 Å2 pour l’interaction secondaire, ce qui conduit à un total de 1 361 Å2 de surface enfouie entre l’homodimère Ivyc et la seconde molécule HEWL.

La structure du complexe confirme la stoechiométrie expérimentale de l’interaction entre Ivyc et HEWL (7) et suggère immédiatement le mécanisme d’inhibition du lysozyme par la molécule Ivyc. Par la formation du complexe Ivyc/HEWL, le site actif du lysozyme est occlus par une boucle qui dépasse de la molécule Ivyc (Fig. 2 c et d). Au centre de cette boucle, un résidu histidine (H60) établit des liaisons hydrogène avec deux des trois résidus responsables de l’activité enzymatique du lysozyme (D52 et E35). La molécule de lysozyme complexée avec Ivyc ne présente pas de changement structurel significatif (rmsd ≈0,5 Å sur 127 résidus d’après la superposition Cα de 1HEL avec les molécules de lysozyme dans le cristal). Cependant, une molécule d’eau est exclue du site actif du lysozyme et remplacée par l’histidine de la boucle inhibitrice d’Ivyc.

La comparaison des structures raffinées d’Ivyc isolé ou complexé avec HEWL (Fig. 2 b et SI Table 2) révèle quelques changements conformationnels mineurs. Ceux-ci incluent l’orientation de la petite hélice (α3) dans les trois monomères de la forme libre d’Ivyc. L’orientation observée dans la molécule A est la plus proche de celle observée dans le dimère Ivyc complexé avec HEWL. Trois hélices 310 (η1, η2, et η3) observées dans la structure Ivyc/HEWL sont absentes dans les trois molécules Ivy non complexées. Plus surprenant encore, la boucle saillante d’Ivy qui interagit directement avec le site actif du lysozyme ne présente pas de changement de conformation notable entre les deux formes cristallines. La rigidité de cette boucle plutôt courte peut s’expliquer par la présence d’un lien disulfure (C57-C62) et d’un pont salin entre le résidu lysine (K58) à côté de la première cystéine et le résidu aspartate (D61) à côté de la seconde cystéine. Ces contraintes structurelles suggérant un type d’interaction clé-serrure avec les lysozymes de type C pourraient expliquer la conservation stricte de la séquence de la boucle entre un sous-ensemble d’homologues d’Ivy (orthologues d’Ivyc) même chez des bactéries lointainement apparentées (Fig. 3 et SI Fig. 5).

Etudes fonctionnelles : Caractérisation de mutants ΔIvy E. coli.

Le rôle central de la boucle CKPHDC dans l’inhibition a été validé expérimentalement par mutagenèse dirigée. Des substitutions d’acides aminés ont été réalisées pour évaluer l’influence de certains résidus d’interaction clés, comme le suggère la structure du complexe Ivyc/HEWL. Comme prévu, nous avons observé une activité inhibitrice plus faible pour les mutants histidine (H60). L’effet le plus drastique (augmentation de 300 fois du K i) a été observé lors de l’introduction d’un résidu aspartique chargé négativement à cette position (SI Tableau 3). Cet effet est très probablement dû à une interaction répulsive avec les deux résidus acides du site actif du lysozyme (D52 et E35). En revanche, aucun changement significatif de l’activité inhibitrice n’a été observé lors de l’introduction d’une mutation C62 → A62 perturbant le pont disulfure.

Nous avons réalisé un knockout du gène ivy de E. coli pour évaluer l’effet protecteur in vivo de la protéine Ivy en présence de lysozyme. Le seul knockout du gène ivy dans E. coli n’a pas présenté un phénotype de sensibilité accrue au HEWL, confirmant ainsi que, dans les conditions de laboratoire, le lysozyme ne pénètre pas la paroi bactérienne (9). Nous avons ensuite construit un double mutant en introduisant une délétion de TolB-pal pour reproduire le phénotype de « paroi cellulaire poreuse » décrit précédemment (10). Il a été démontré précédemment que les mutants ΔtolB d’E. coli présentent un phénotype typique de sensibilité aux médicaments et aux détergents, de fuite et de formation de vésicules de la membrane externe (10, 11), en raison d’une synthèse altérée de l’enveloppe. Nous avons mesuré la sensibilité au lysozyme du double mutant ΔtolBΔivy par rapport au mutant ΔtolB (JC864). Dans des conditions de laboratoire, le mutant ΔtolB s’est avéré sensible à des concentrations de lysozyme supérieures à celle trouvée dans les sécrétions (>50 μg-ml-1 ; SI Fig. 6), démontrant ainsi que des molécules de la taille d’une protéine, en plus des petites molécules, peuvent pénétrer de telles cellules E. coli fuyantes. Le mutant ΔtolBΔivy a ensuite été testé et il s’est avéré qu’il présentait une plus grande sensibilité à HEWL, car pour des concentrations physiologiques (50 μg-ml-1 ; Fig. 4 a), l’effet du lysozyme sur la croissance bactérienne était déjà visible, soutenant le rôle protecteur d’Ivyc. Cet effet protecteur a été confirmé par la surexpression d’Ivyc dans un double mutant ΔtolBΔivy portant un plasmide d’expression inductible par l’isopropyl β-d-thiogalactoside (Fig. 4 b) où l’expression d’Ivyc était capable de restaurer la croissance bactérienne pour des concentrations de lysozyme allant jusqu’à 500 μg-ml-1. Des résultats similaires ont également été décrits dans le cadre d’autres traitements perméabilisants (9).

La famille des protéines Ivy : Distribution phylogénétique.

Une recherche exhaustive des homologues de la protéine Ivy d’E. coli a été effectuée en utilisant toutes les données de séquence accessibles au public, y compris les séquences complètes du génome bactérien et les données des projets de séquençage en cours de tous les principaux centres de séquençage du génome (voir Matériaux et méthodes). Toutes les séquences d’homologues d’Ivy identifiées ont été utilisées de manière itérative comme requêtes pour optimiser la détection de parents plus éloignés dans l’évolution. Un total de 35 séquences distinctes de type Ivy ont été identifiées (allant de 100% à <25% d’identité de séquence avec la protéine Ivy de E. coli K12). Il est surprenant de constater que les homologues de Ivy ne sont identifiés que chez les membres des protéobactéries (bactéries Gram-négatives), et qu’ils sont tous prédits comme étant périplasmiques (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). D’un côté, il peut sembler logique que les protéines Ivy se localisent avec la partie protéoglycane (le substrat du lysozyme) dans le compartiment périplasmique. D’autre part, on pense que le réseau de protéoglycanes est physiquement protégé de l’attaque d’enzymes exogènes par la paroi cellulaire des protéobactéries et n’est pas considéré comme un substrat naturel du lysozyme. La présence d’un gène codant pour un inhibiteur du lysozyme chez les bactéries Gram-négatives plutôt que chez les bactéries Gram-positives est donc un paradoxe. L’arbre phylogénétique des homologues de Ivy est présenté dans la Fig. 3, selon les divisions standard des Proteobacteria (12) : alpha, beta, gamma, delta, et epsilon. A ce jour, la famille de protéines Ivy est la plus représentée dans les divisions gamma et beta, mais deux homologues de Ivy ont été identifiés sans ambiguïté dans deux espèces non apparentées de la division alpha : Parococcus denitrificans et Gluconobacter oxydans. Dans les divisions gamma et bêta, les homologues de Lierre sont distribués sporadiquement. Par exemple, les homologues de Ivy sont présents dans toutes les entérobactéries, à l’exception de Salmonella, mais on les trouve également dans toutes les Pseudomonadaceae séquencées. De même, dans la division bêta, les homologues de Ivy sont présents dans tous les Burkholderia, sont identifiés dans une seule espèce de Neisseriaceae, et sont absents de nombreux autres génomes séquencés de cette division. Une telle distribution sporadique de la famille des protéines Ivy dénote une histoire évolutive sous-jacente complexe faite de pertes différentielles de gènes à travers les clades superposées à des événements de transferts horizontaux comme le suggère une analyse phylogénétique détaillée (Fig. 3). À l’exception des alphaproteobactéries, la plupart des espèces hébergeant des orthologues d’Ivyc sont des agents pathogènes ou opportunistes pour l’homme ou d’autres vertébrés.

Homologues orthologues vs homologues paralogues d’Ivy.

La plupart des membres identifiés de la famille des protéines Ivy, y compris les homologues les plus proches d’Ivy d’E. coli, présentent une conservation absolue de la sous-séquence CKPHDC (SI Fig. 5a ). Ce motif coïncide exactement avec la boucle inhibitrice du lysozyme identifiée dans la structure 3D du complexe HEWL/Ivyc et dans nos études fonctionnelles des mutants de boucle Ivyc (voir ci-dessus). Sur la base de ces données, nous avons classé les homologues d’Ivy présentant cette séquence en boucle comme de véritables orthologues du gène ivy d’E. coli (c’est-à-dire qu’ils sont censés être des inhibiteurs du lysozyme et remplir la même fonction dans leurs espèces respectives). Deux autres séquences orthologues présentent une conservation presque exacte de la boucle, le résidu aspartate étant remplacé par un résidu asparagine dans la séquence Burkordelia cepacia Ivy (48 % d’identité avec Ivyc) et le résidu lysine étant remplacé par un résidu arginine dans la séquence Gluconobacter oxydans 621H Ivy (26 % d’identité avec Ivyc). Les analyses de ces mutations dans le contexte de la structure 3D du complexe Ivyc/HEWL suggèrent qu’elles devraient toutes deux être compatibles avec une interaction correcte entre le lysozyme et Ivy et donc avec l’inhibition du lysozyme. Les cinq homologues d’Ivy restants qui présentent des séquences de boucles non canonique ont ensuite été appelés paralogues d’Ivy d’E. coli (c’est-à-dire qu’ils sont censés avoir des fonctions différentes) (SI Fig. 5b ). Les paralogues d’Ivy ne se trouvent que dans les espèces du genre Pseudomonas : P. aeruginosa, P. syringae, P. putida, et P. fluorescens, tous avec des séquences de boucles CExxDxC apparentées, mais différentes. De plus, P. aeruginosa est la seule espèce qui présente à la fois une version orthologue et une version paralogique de Ivy. La séquence orthologue d’Ivy de P. aeruginosa est également la plus similaire à la séquence paralogue d’Ivy de P. aeruginosa, ce qui suggère fortement qu’une duplication de gène menant à la boucle non canonique dans les paralogues d’Ivy s’est produite le long de la branche menant aux Pseudomonadaceae. L’absence d’homologues de Lierre dans le genre proche Acinetobacter pourrait être causée par des pertes de gènes ultérieures.

Expression et caractérisation fonctionnelle des homologues de Lierre de P. aeruginosa.

Pour tester nos prédictions fonctionnelles concernant les formes orthologues par rapport aux formes paralogues de Lierre, nous avons exprimé (voir Matériaux et Méthodes) le produit des deux gènes liés à Lierre de P. aeruginosa. Les deux protéines appelées Ivyp1 (orthologue) et Ivyp2 (paralogue) ont été purifiées et testées pour leur activité inhibitrice contre HEWL. Comme prédit à partir de leurs séquences de boucle respectives, la protéine Ivyp1 (CKPHDC) s’est avérée inhiber l’activité du lysozyme, alors que Ivyp2 (CEKSDC) ne l’a pas fait. Le résultat de l’inhibition de l’activité HEWL par Ivyp1 est présenté dans la figure SI 7a . Comme pour Ivyc, l’inhibition suit un mécanisme de  » liaison étroite lente  » avec un Kiapp {Ivyp1, HEWL} de ≈25 nM.

Structure de P. aeruginosa Ivyp1 (Code PDB 1UUZ).

Après la démonstration que P. aeruginosa Ivyp1 et E. coli Ivy présentaient des activités antilysozymes similaires, nous avons déterminé la structure du complexe Ivyp1:HEWL pour visualiser comment l’interaction inhibitrice était préservée malgré la lointaine similitude de ces deux séquences protéiques Ivy (30% de résidus identiques ; SI Fig. 5a ). Comme prévu, la structure d’Ivyp1 est similaire à la structure monomère d’Ivyc. Cependant, comme prédit par la non-conservation des résidus impliqués dans la formation du dimère Ivyc, P. aeruginosa Ivyp1 est un monomère.

Malgré cette différence significative, l’interaction des deux homologues d’Ivy avec la molécule de lysozyme est remarquablement similaire (Fig. 2, SI Fig. 7b , et SI Table 4). Le Cα rmsd entre les monomères Ivyp1 et Ivyc est de ≈2,8 Å. Nous avons ensuite comparé les surfaces d’interaction dans les deux complexes pour identifier les résidus clés responsables de la robustesse de l’interaction Ivy-lysozyme. Dans les deux complexes Ivy, l’interaction Ivy-HEWL implique la même quantité de ponts salins, de liaisons hydrogène impliquant des chaînes latérales, de chaînes latérales/chaînes principales et d’interactions entre chaînes principales. Cependant, parmi les nombreux résidus impliqués dans l’interaction avec le lysozyme, seuls trois sont strictement conservés : le résidu histidine (H60 dans Ivyc, H62 dans Ivyp1) formant à la fois une liaison hydrogène directe (E35-OE1) et une liaison hydrogène indirecte à travers une molécule d’eau (D52-OD1) au sein du site actif de HEWL, un résidu aspartate (D61 dans Ivyc et D63 dans Ivyp1), et un résidu glutamate (E120 dans Ivyc et E123 dans Ivyp1). Nous avons ensuite comparé les zones d’interaction dans les deux complexes. En raison de l’état dimérique de la molécule Ivyc, la surface enfouie lors de la formation du complexe Ivyc-HEWL est plus importante (≈1 340 Å2) que pour le complexe Ivyp-HEWL (≈1 000 Å2). Cette différence explique probablement l’activité inhibitrice plus faible (diminution de 25 fois) d’Ivyp1 par rapport à Ivyc.