全レーン：βアクチン抗体-ローディングコントロール(ab8227)1/5000希釈
レーン1：HeLa全細胞抽出液
レーン2． 酵母細胞抽出液
レーン3: Mouse brain tissue lysate
- 利用可能なポジティブコントロールライセート、ブロッキングペプチド、ポジティブコントロールタンパクのリストを見る。
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プロトコルはAbcamの研究室でAbcamの試薬と製品を使って行った実験に基づいてAbcamが「そのまま」提供しているものです。
Webinar transcript
ウェスタンブロッティングの目的は、ゲル上のタンパク質を分子量に応じて分離することです。 その後、タンパク質は膜上に転写され、抗体を用いて検出されます。 β-メルカプトエタノールなどの還元剤を含むサンプルバッファーを用いて、サンプルを95℃で5～10分加熱します。
電気泳動槽にゲルを入れ、ウェルの上部を覆うようにバッファーを加えます。
電気泳動槽にゲルを入れ、ウェルの上部が覆われていることを確認しながら、バッファーを入れます。 最初のレーンに分子量別のマーケットを配置し、隣のウェルにサンプルをロードします。 すべてのサンプルには、同量のタンパク質が含まれています。 全てのサンプルを投入した後、ランニングバッファーを加え、電気泳動槽に蓋をします。 電源を入れ、ゲルのメーカーが推奨する電圧をゲル槽に設定します。 タンクの中を気泡が上がってくるのが見えるはずです。
次の段階では、ゲルからタンパク質を膜に移します。 メンブレンは通常、ニトロセルロースやPVDFで作られています。 タンクからゲルを取り出し、プラスチックケースから慎重に離します。 ウェルとゲルの脚部を切り取り、ゲルを転写バッファーに入れます。 メンブレンとゲルを濾紙とスポンジで挟んでトランスファースタックを準備します。 メンブレンはプラスの電極に、ゲルはマイナスの電極に最も近いところで挟みます。 小さなローラーを使って、ゲルとメンブレンの間の気泡を取り除きます。 トランスファーケースのキャップを閉めて、トランスファーバッファーの入ったトランスファータンクに沈めます。 システムを冷やすために外槽に水を加え、蓋をします。 電源を入れてタンパク質の転送を開始します。 時間と電圧は最適化が必要なので、メーカーの説明書を確認してください。
タンパク質がゲルからニトロセルロース膜に移行したところで、目的のタンパク質を抗体として検出することができます。
ゲルからニトロセルロースメンブレンにタンパク質が移動したところで、目的のタンパク質を抗体として検出することができます。メンブレンをカセットから取り外すと、分子量市場が見えます。 必要に応じて、膜を溶液で染色することにより、タンパク質の移動を確認することができます。 抗体の非特異的結合を防ぐために、メンブレンをブロッキングする必要があります。 ブロッキングバッファーをメンブレンに注ぎ、 ロッカーで静かに撹拌します。 一般的には、5％の牛乳またはウシ血清アルブミン（BSA）の溶液を用いて、室温で2時間、または4度で一晩、これを行います。 時間やブロッキングバッファーの種類は最適化する必要がありますので、詳細は使用する予定の一次抗体のデータシートを確認してください。
メンブレンがブロッキングされた後、ブロッキングバッファーを取り除き、同じ溶液で希釈した一次抗体を加えます。
メンブレンをブロッキングした後、ブロッキングバッファーを取り除き、同じ溶液で希釈した一次抗体を加えます。 通常、一次抗体のインキュベーションは、室温で1時間、または4℃で一晩です。抗体の濃度とインキュベーション時間は最適化する必要があります。 抗体のデータシートを参考にしてください。 一次抗体を除去し、メンブレンを洗浄バッファーで2回すすぎます。 その後、15分間の洗浄を1回、10分間の洗浄を3回、ロッカーで行います。
洗浄バッファーを流して、ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体とメンブレンをインキュベートします。 通常は室温で1時間インキュベートしますが、抗体の濃度やインキュベート時間を最適化する必要があります。
検出にはいくつかの異なったシステムがありますが、二次抗体を引き抜いてメンブレンを洗浄します。 二次抗体が酵素に結合している場合は、イメージングの前に適切な基質でメンブレンをインキュベートします。 二次抗体が蛍光結合体の場合は、直接イメージングのステップに進むことができます。 イメージングは、X線フィルムまたはデジタルイメージングシステムを使って行うことができます。 メンブレンをイメージングトレイにセットします。 イメージングトレイをイメージングシステムにセットします。 目的のタンパク質に関連するバンドを明確に検出するためには、おそらく露光時間を最適化する必要があります。