Heading

概要

はじめに。 プルキンエ系と偽腱（FT）は心室性不整脈に関連しているが、プルキンエ線維とFTの関連は明らかではない。 本研究では，プルキンエ線維とFTの間の解剖学的および電気生理学的特徴の関連性を調べた。 方法と結果 プルキンエ線維の解剖学的構造を調べるために，ルゴールのヨウ素溶液による染色法を最適化し，電気生理学的特性を調べるために，ダイレクト・ビジュアル・マッピング（DVM）法と名付けた新しい電気生理学的マッピング法を考案した。 12頭の犬に上記の工夫を施した結果、以下のことがわかりました。 弁輪の0.5cm～1.0cm下、僧帽弁の弁尖や腱膜、乳頭筋の上部1/3に隣接する部分には、プルキンエ線維は見られなかった。 (2)プルキンエ線維は、小さい・極小のFTを含むすべてのFTに存在していた。 (3)FTに含まれるプルキンエ線維は近位端から遠位端まで伸びており、その電気生理学的特性は心内膜上の線維と同様であり、前向性、逆向性、減弱性の伝導と自動性を有していた。 結論としては プルキンエ線維はFTによく見られる。 FTに含まれるプルキンエ線維の電気生理学的特徴は、心内膜上の線維と類似している。 FTは心室性不整脈の解剖学的および電気生理学的基礎を持っているかもしれない。

1. はじめに

プルキンエネットワークは、心室の電気伝導を担う心臓内の特殊な伝導系であり、単形性心室頻拍（VT）、多形性心室頻拍（VT）、心室細動（VF）など、ある種の心室性頻拍不整脈（プルキンエ関連不整脈と呼ばれる）のメカニズムにも関与していると言われています。 偽腱(FT)は一般的な心室内の解剖学的変化である。 これは、心室内に存在する、乳頭筋と僧帽弁または三尖弁の正常な接続部以外の線維状または線維筋状の構造物を指す。 多くの臨床研究により、FTは心室性不整脈と密接な関係があることが示されている 。 特発性左心室頻拍（ILVT）は、左心室から発生する一般的なリエントリー性心室不整脈です。 その解剖学的基質がFTと密接に関係していることが報告されています。 また、FTは心室性早産の発生にも関係しています。 FTは心室性不整脈の解剖学的、電気生理学的基盤を持っているのだろうか？ これまでの研究では、FTにはプルキンエ細胞が見つかっています。 しかし，FTにプルキンエ線維が存在するのは，偶然なのか，それとも一般的な現象なのか。

2.材料と方法

2.1. 心臓の単離と準備

本研究における動物実験のプロトコルはすべて、北方劇場司令部の総合病院のInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)によって承認されています。

本研究では12匹の雑種犬（21.5±2.5kg）を使用した。 これらの犬は、ミダゾラム（0.5mg/kg IM）で麻酔した後、大腿静脈に空気（100～150ml）を注入して死なせた。 心臓は、死後すぐに胸骨内側から切開して採取した。 それぞれの実験目的に応じて、心臓はできるだけ早く準備し、処理した。 6つの心臓の心内膜をルゴール液で染色し，プルキンエ線維の解剖学的構造を観察した。 また，別の6つの心臓を用いて，ビジュアルマッピング法によりプルキンエシステムの電気生理学的特性を観察した。 ルゴール溶液による染色とビジュアルマッピングのための心臓の準備方法は以下の通りである。 まず，in vitroの心臓を僧帽弁輪から左自由壁心室に沿って心尖部まで切開し，大動脈輪を切開して左心室前部および後部乳頭筋を完全に露出させた。 その後、心内膜を比較的平坦にし、綿棒を用いて心内膜上の残留血液を除去した。

2.2. ルゴール溶液による染色

ルゴール溶液は、I2（4％、）とKI（4％、）を温和な条件で脱イオン水に溶解して、あらかじめ（1週間以内に）調製し、遮光した。 準備した心臓の心内膜にルゴール液を均一に噴霧し，0.5～2分間浸漬してプルキンエ線維を染色した。 色が薄くなったり消えたりした場合は、染色作業を繰り返した。 小さくて複雑な解剖学的構造を明らかにするために、実体顕微鏡（解剖学用レンズ）を使用した。

2.3. 組織染色

心臓は10％ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、5μmのスライスに切り出した。 組織切片はヘマトキシリン・エオジン(HE)染色、マッソン染色、過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色、コネキシン40免疫組織化学染色を行った。 ダイレクトビジュアルマッピング法

準備した心臓を温めた(37℃)乳酸リンゲル液に浸した。 2本の20電極高密度カテーテル（1mm電極、1mm間隔）を、プルキンエ線維の分岐部、前または後乳頭筋、FTなどの直視下の関心領域に密着させた。 そして，プログラム刺激，アクティベーションマッピング，ペースマッピングなどの電気生理学的研究とマッピングをin vitroで行った。 持続する不整脈（VTやVFなど）がペースターミネイションできない場合や、自動電気活動を停止する必要がある場合は、心臓を低温（<10℃）の乳酸リンゲル液に5秒間浸漬した。 この心内膜マッピング法をdirect visual mapping (DVM)法と呼ぶ。 プルキンエ線維の解剖学的特徴

左His-プルキンエ系は非冠状動脈洞と右冠状動脈洞の境界の下から発生した。 左と右の束枝を生じていた。 非冠状動脈洞と右冠状動脈洞の間の左His束を除いて、大動脈弁と僧帽弁を含む弁輪の0.5cm〜1.0cm下にはプルキンエ繊維枝は見られなかった。 僧帽弁の弁尖や鎖骨腱膜にはプルキンエ繊維の枝は見られなかった。 左前枝または後枝の主要な枝はFTに広がり、乳頭筋の側壁につながっていた。 しかし、乳頭筋の上部1/3に隣接するプルキンエ繊維の枝は見られなかった（図1）。

(a)

(b)

(c)

。

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

図1

左心室心内におけるプルキンエ線維の分布。 a，d）僧帽弁下0.5cm以内にはプルキンエ繊維の分岐は見られず，（b，e）大動脈弁下0.8cm以内にはプルキンエ繊維の分岐は見られないことを示し，（c，f）乳頭筋の先端にはプルキンエ繊維の分岐は見られない。 MVLは僧帽弁尖，LCCは左冠状動脈カスプ，RCCは右冠状動脈カスプ，

3.2. FTの解剖学的特徴

FTは12頭すべての犬の心内膜に見られ、その長さは様々であった。 全部で19個のFTが1cmより長かった（平均2.4±1.03cm、12頭それぞれに1～3個）。 また、0.5〜1cm程度の小さなFTが66本（12頭で2〜8本）あり、0.5cm以下の小さなFTが各犬に多く見られた。 19個の長いFTのうち、5個は前乳頭筋につながり、12個は後乳頭筋につながり、残りの2個はどの乳頭筋にもつながっていなかった。 小さくて小さなFTも含めて、すべてのFTにプルキンエ線維が含まれている。 FTに含まれるプルキンエ線維は、近位端から遠位端まで伸びており、心内プルキンエ線維を乳頭筋や隣接する心内プルキンエ線維に接続していた（図2）。 興味深いことに、大きなFTには典型的な心筋と血管拡張が存在していた（図3）。 逆に、乳頭筋と僧帽弁尖とを連結している帯状腱には、プルキンエ線維も心筋も存在しなかった（図2）。

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

図2

脊柱管（真性腱）およびFT上のプルキンエ線維の分布特性。 a）犬の心内膜におけるルゴール液染色。 プルキンエ線維が濃く染まっている。 (b, c, d) 僧帽弁につながっている帯状腱にはプルキンエ線維が含まれていない。 (b) (a)の拡大された三角形の領域。 (c) 腱鞘のMasson染色（100倍）。 (d) 腱鞘のコネキシン40免疫組織化学的染色（100倍）。 (e, f, g, h) すべてのFTにプルキンエ線維が含まれている。 (e) (a)の拡大した星の部分(5倍)。 (f) (e)の拡大矩形領域 (g) FTのマソン染色(100倍)。 h）FTのコネキシン40免疫組織化学的染色（100倍）。

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

プルキンエ線維。 典型的な作業心筋，および大きなFTにおける血管拡張（50倍）。 a）HE染色；（b）マッソン染色；（c）PAS染色；（d）コネキシン40免疫組織化学染色。 M, 作動中の心筋; , プルキンエ線維; 黒矢印, 血管内径。 FT上のプルキンエ線維の電気生理学的特性

DVM法を用いて、左心室をペーシングしたり、自動電気活動を記録したりすることで、採取した心臓の心室内膜にプルキンエ線維の電気活動を記録した。

FT上のプルキンエ線維の電気生理学的特性は、心内膜上の線維と同様に、双方向性伝導と自動性を有していた（図4）。 また、FT上のプルキンエ線維では、特にわずかな牽引による機械的損傷時に伝導の低下が見られた（図4）。 FTの重なり部分には複数列のプルキンエ電位が記録されていた（図5）。

図4

DVM法による心内膜の電気生理学的マッピング。 a）2本の20電極マッピングカテーテルを，LV中隔上部から心尖部までのLV中隔心内膜に配置した。 マッピングカテーテルの1本（P1〜P20）はFTの1つに貼り付け，もう1本（P21〜P40）は隣接するプルキンエネットワークに配置した。 ペーシングポイントはFTの近位端にある（赤い星印）。 (b) 犬の心内膜におけるルゴール液染色。 プルキンエ線維が濃く染まっている。 (c) 近位FTからペーシングした場合、400msのサイクル長では、FTに含まれるプルキンエ線維の伝導方向は近位端から遠位端へ、心尖端のプルキンエ線維の伝導方向は遠位端から近位端へとなった。 ペーシングを止めた後、FTからのプルキンエ繊維の自動性（4～8拍目）が観察された。 d）250msの周期長でペーシングすると，プルキンエ線維の減少伝導が起こり，プルキンエ線維の活性化配列は400msペーシング（c）と同じであった。

(a)

(b)

(a)
(b)

図5

FTの重なり部分に複数の電位を記録した。

4.考察

4.1. 主な知見

心房内にはプルキンエ線維が広く分布しており、心房内プルキンエ線維と乳頭筋や隣接する心内膜のプルキンエ線維をつないでいた。 FTに含まれるプルキンエ線維の電気生理学的特性は、心内膜上のプルキンエ線維と類似していた。

4.2. 左心室内膜におけるプルキンエシステムの解剖学的分布

心内膜におけるプルキンエ線維の分布には一定の特徴があります。 本研究では、心内膜にプルキンエ線維が広く分布しているにもかかわらず、僧帽弁下と乳頭筋上1/3にはプルキンエ線維の枝が見られない。 また、大動脈弁下の左心室流出路には、非冠状動脈洞と右冠状動脈洞の間の左His束を除いて、プルキンエ繊維枝は存在しない（図1）。 これらの特徴は、心室性不整脈のメカニズムを解析する上で非常に重要である。 例えば、RCC領域から発生する早発心室複合体（PVC）をマッピングする場合、PVCのQRS波の前でRCCに隣接して高周波の電位がよく記録される。 この電位をプルキンエ繊維電位と考えてはいけません。

4.3. FTの解剖学的および電気生理学的特徴

FTは、左心室の空洞を横断する単一または複数の、薄い、繊維状または繊維筋状の構造物で、弁尖とは関係ありません。 FTは犬の心内膜に非常によく見られる。 FTには線維組織、心筋線維、プルキンエ線維、血管が含まれていることが報告されている。 プルキンエ細胞は、調査した標本では観察されなかった.

私たちは、小さくて小さなFTも含めて、FTにはプルキンエ繊維がよく見られることを発見した。 FTに含まれるプルキンエ線維は、近位端から遠位端まで伸びている（図2）。 FTに含まれるプルキンエ線維の電気生理学的特性は、双方向性伝導、減少性伝導、自動性など心内膜上の線維と類似していた（図4、5）。

FTとプルキンエ繊維系の相関関係は、FTが心室不整脈に関与している解剖学的、電気生理学的根拠になるのではないかと推測している。 プルキンエ繊維系（FTを含む）が機械的牽引、虚血、低酸素などの影響を受けると、それに応じて電気生理学的特性が変化し、心室性不整脈が発生するのではないかと考えられる。 臨床的意義

心エコー検査を受けた患者におけるFTの有病率の報告は、小児では0.8%から61%、成人では0.3%から71%と大きな差があります。 いくつかの研究では、FTが、特発性心筋梗塞性VTや構造的心疾患に伴うVTなどの心室性不整脈、特に虚血性心疾患の一部の患者に重要な役割を果たしている可能性が報告されている。 諏訪らは，FTを外科的に切除するとILVTが起こらなくなると報告している。

プルキンエ線維とFTの間には相関関係があるため、FTはさまざまな心室性不整脈に関与している可能性があります。

プルキンエ繊維とFTの相関関係から、FTは様々な心室性不整脈に関与していると考えられています。 しかし、正確なリエントリー回路、特に遅伝導領域の基質については、いまだに不明な点が多い。 LPF-VTのいくつかの症例では、LPFの中隔部と乳頭筋を結ぶFTがリエントリー回路の一部であることが確認された。 しかし、LPF-VTのほとんどの症例では、かなりのFTが検出されなかった。 本研究では，心内膜上の隣接するプルキンエネットワークを結ぶ微小なFTが検出された。 この小さなFTがLPF-VTのリエントラント回路に重要な役割を果たしているのではないかと考えられた。 FTと隣接するプルキンエネットワークとの間の急激なターンまたは異方性伝導が、遅伝導帯の基質であるかもしれない（図6）。

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

となります。

図6

特発性左心房性心室頻拍のリエントラント回路の可能性に関する我々の仮説の概略図。 (a) 洞調律時のプルキンエネットワークの解剖学的構造と伝導パターン。 洞調律時には、His-Purkinje系の主枝（先端階層）がアンテグレード活性化シーケンスを示し（P2、赤線と矢印）、その後、基底階層のPurkinjeネットワークをレトログラード活性化した（P1、青線と矢印）。 緑色の線と矢印は、同じ基底階層のプルキンエネットワークと異なる階層のプルキンエネットワークの間の微小なFTを表している。 (b)VTの際、リエントラント回路はプルキンエ線維ネットワークの周辺にあり、微小なFTによって遅伝導帯として接続されている可能性がある（赤線と矢印）。 なお、左後筋群（P2）はリエントラント回路の傍観者である。 (c) 稀なケースのVTでは、プルキンエネットワークと乳頭筋をつなぐ長いFTから遅伝導帯が発生した（赤線と矢印）。 (d) (b)の特発性左房状動脈性VTの考えられる解剖学的基盤 (e) (c)の特発性左房状動脈性VTの考えられる解剖学的基盤 LPFは左後筋群，LAFは左前筋群，LLPFは下層または基底層のプルキンエ線維，PMは乳頭筋

4.5. 制限事項

本研究にはいくつかの制限事項がありました。 まず、本研究はin vitroの動物実験であり、電気生理学的特性はin vivoまたはランゲンドルフ灌流心臓モデルのものとはある程度異なる可能性があります。 第二に，プルキンエ線維の電気生理学的特性を詳細に視覚的にマッピングするために利用できる時間が限られていた。 第3に，小さいFTの特徴や，ベラパミルやカテコラミンに対する反応は，今回の研究では十分に明らかにされていない。 今後、小型・微小FTの組織学的および電気生理学的特性について、さらに研究を進める必要があります。 結論

プルキンエ線維は犬のFTに広く分布しており、小型のFTも含まれている。

Data Availability

この研究の結果をサポートするために使用された統計および画像データは、論文内に含まれています。

Conflicts of Interest

著者は、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言します。

Acknowledgments

著者は、組織学的染色の技術的支援をしてくれたHongyue Wang博士と、言語のレビューをしてくれたShehata博士に感謝します。 本研究はNational Key Project of Research and Development (contract nos. 2016YFC0900900, 2017YFC1307800, and 2016YFC1301300)の支援を受けました

。