Recruitment and Sampling Strategy :
参加者はイギリスのチェスター大学内でのみ募集します。 対象となるグループ（スタッフと学生）への広告媒体として、電子メールとポスター/リーフレットを使用します。 19歳から40歳までの閉経前女性62名が、以下の基準に基づいて本研究に参加する。 参加資格は、試験開始前のスクリーニングでの血清フェリチンおよびビタミンD濃度に基づきます。 参加者には、健康状態、薬剤・薬・サプリメントの使用状況、最近の病気・外傷・怪我についての情報を記載したスクリーニング用の質問票を記入してもらいます。 6mlの静脈血を採取し、血漿フェリチン、ビタミンD、ヘモグロビン、および全血球数を測定する。血漿フェリチン濃度が20.0μg/L以下、ビタミンD濃度が250nmol/L以下の参加者は、本研究に参加する。 ヘモグロビン濃度が重度の貧血段階であることが判明した場合、参加候補者に通知し、一般開業医（GP）に相談するよう助言する（ヘモグロビン濃度< 8.0 g/dL）。 研究開始前に、すべての適格な参加者に研究プロトコルの説明を行い、適格な参加者には参加者情報シート（PIS）を渡し、書面によるインフォームドコンセントを求めます。
8週間の二重盲検無作為化対照試験を英国（United Kingdom）のチェスターで実施します。 特に非貧血グループにおいて、赤血球生成骨髄を一般的に拡大し、赤血球指標の変化を観察するには1ヶ月以上の期間が適切であることから、8週間の介入期間を選択しました。 ほとんどのビタミンD研究では、1000IUのサプリメントを使用しており、被験者に副作用がないことが報告されている。 一部の研究では、1600IUや4000IUといった高濃度のビタミンDを使用していますが、被験者の有害な結果は報告されていません。
参加者は2つのグループに無作為に割り当てられます。
- 鉄グループ（鉄分強化朝食シリアルとプラセボ）
- ビタミンDグループ（鉄分強化朝食シリアルとビタミンD3）
各参加者は、合計9mgの鉄分を含む60gの鉄分強化朝食シリアルを、割り当てられたグループに応じてビタミンD3プラセボまたはビタミンD3（1500IU）と一緒に8週間摂取します。 被験者は、朝に鉄分強化朝食用シリアルを1日200mlの半脱脂牛乳と一緒に8週間にわたって摂取する。 ビタミンDまたはプラセボは，夕方に200mlの水と一緒に摂取します。 参加者は、研究期間中、食生活と身体活動を維持するよう求められます。 また、研究期間中は献血をしないように求められます。
参加者は8週間の間に合計3回のクリニックに出席することが求められ、ベースライン（0日目）、中間（4週目）、介入後（8週目）に評価されます。 参加者は、すべてのクリニックの前に一晩、約8時間の絶食をお願いします。 各クリニックでは、30mlの血液サンプルを採取し、身長（cm）と体重（kg）を測定します。 研究開始前と終了時には、参加者の習慣的な食事摂取量を表すために、平日2日と週末1日の計3日間の食事日記をつけることが求められる。
サンプルサイズと正当性：
サンプルサイズは、Scholz-Ahrensら（2004）が実施した研究の鉄分補給データを用いて推定しました。 その結果、介入後8週間の血清フェリチン濃度（平均±S.D）は、17.7±11.8ug/l（鉄分強化牛乳群）および10.6±8.1ug/l（非強化牛乳群）と報告されました。 効果量を0.7015447とすると、今回の研究で各群に必要なサンプル数は26となる。 20％の脱落率を考慮すると、必要な総サンプル数は31となります（Power = 0.80）。 したがって，研究全体で必要なサンプルサイズは 62 となる．
統計分析：
すべての統計分析は、International Business Machines (IBM) Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) Statistic Data Editor Software (Version 21)を使用して行われます。 シャピロ・ウィルクス正規性検定を実施してデータが正規分布していると仮定し、反復測定による一元配置分散分析（ANOVA）を実施して、ベースライン、中間期、介入後の各グループにおけるすべての測定パラメータの平均差を比較します。 研究期間中の測定パラメータの変化は、ペアt-テストを用いて分析します。 ヘプシジンプロファイルと鉄分状態のバイオマーカーとの関係を調べるために、ピアソンの相関検定を実施する。 すべての分析において、データが正規分布していない場合は、ノンパラメトリックなアプローチを採用する。 差異はp値≦0.05で有意とする
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