History
牛のクローン作成は、1986年に私たちの研究室で、核分裂したメタフェースIIの卵母細胞に胚切断期の核ドナー細胞を導入することから始まり、その結果、2頭の健康な子牛が妊娠・出産しました（Prather et al. 私たちの成功とグラナダジェネティクス社の成功がほぼ同時に実現したのは、いくつかの要因があったからです。 両生類の研究では、核を持った前核の接合体よりも、核を持ったメタフェーズの卵母細胞に核を移すことで、より高度な発達が起こることが示されました（Hoffner and DiBerardino, 1980）。 マウスを使った研究では、核をマイクロインジェクションではなく、マウスの卵母細胞に融合させた場合、核移植（NT）後の発生頻度が非常に高いことが明らかになった（McGrath and Solter, 1983）。 羊を対象としたWilladsen(1986)の研究では、胚性幹細胞を無核化したメタフェースIIの卵母細胞に電気融合させることで、子羊を生産できることが示された。 体外で胚を作る方法や胚盤胞まで培養する方法が登場したことで、牛のクローニングの登場も促進されました。牛の胚は胚盤胞の段階で牛に移植して子孫を残すのが一般的だったからです（First, 1990; Gordon, 1994; Fulka et al,
これらの初期の研究では、胚性幹細胞は全能であるが、体細胞や胎児の分化した細胞は全能ではないことが両生類の初期の文献で示唆されていたため、乳頭期からモーラ期までの胚性幹細胞が核分裂したメタフェース卵母細胞への移植に使用されました(DiBerardino, 1988; DiBerardino, 1997)。 このことは、Navaraら（1994）のような研究によって哺乳類で確認された。 この研究では、極性細胞と栄養細胞系のコミット細胞を核ドナーとして使用したところ、胚盤胞期の胚が非常に少なかった（7％；n＝158）のに対し、非極性細胞と非分化細胞を核ドナーとして使用したところ、高頻度で胚盤胞が得られた（47％；n＝184）。 一方、139個の無選別胚のうち30％が胚盤胞まで発育しました。 1980年代に、非分化細胞のみが核ドナーとして発育に有効であるという結論が出されたのは、人工的な方法では精子のように迅速かつ効果的に卵子を活性化できないという技術的な制約があったからです（Ware et al.、1989）。 そのため、分化した核を再プログラムする能力を失った老化した卵母細胞を使用せざるを得なかったのである。 若い卵子と老化した卵子の比較を第一研究室の表20.1に示します。 実際、初期の多くのプロトコールでは、ドナー細胞の核膜とその内容物が、核膜の破壊なしに完全に保持されるほど卵子を老化させたときに、最高の成功が得られました（Saekiら、1991年、Leibfried-Rutledgeら、1992年、Poccia and Collas、1997年）。 中程度の年齢の卵子であれば、核膜の破壊は可能ですが、核膜を速やかに再構築し、核からクロマチンの一部を取り除くことができます。 核移植における若い卵子と高齢の卵子の使用
| プロセス | 24時間 | 48時間 | |
|---|---|---|---|
| 人工的な? 活性化 | Poor | Excellent | |
| 核エンベロープの分解と再構築 | Yestd | いいえ | |
| 核と卵子の同期 | 必須 | 非必須 | |
| 細胞およびゲノムの | |||
| 細胞とゲノムの再プログラム | はい | いいえ | |
| 活性化のシーケンスとタイミング | 重要 | 重要ではない | 重要ではない |
| 成功したドナー細胞 | 分化した成人または胎児 | 直立した胚芽 |
若いウシの卵母細胞を活性化することができるようになったのは、メタフェース促進因子（MPF）や細胞増殖因子の活性をより完全かつ継続的に抑制する手順を開発したことによります。
活性化は、イオノフォア処理の後にシクロヘキシミド（CHX）でタンパク質合成を阻害し、続いてシトカラシンB（CB）でインキュベートすることで、細胞からのクロマチンの押し出しを防ぎ、二倍体の状態を維持することでも達成できます（Liu and Yang, 1999）。 Bhakら（2006）は、牛の異なる活性化処理を施したNTで作られた胚の発育速度と倍数性を研究した。 この研究では、イオノマイシン単独、イオノマイシン＋DMAP、イオノマイシンとCHXという3つの卵子活性化方法を、SCNTで作製した胚のパーセンテージとIVF対応の胚の発育について比較しました。 その結果、イオノマイシンの後にDMAPを処理すると、パルテノテの発生率が大きく上昇するが、CHX処理と比較して胚盤胞の発生には差がなかった。 しかし、DMAP処理は、時間依存的に2細胞期胚への開裂率を増加させました。 さらに、パルテノ-トやSCNT胚の染色体異常の発生率を大幅に高めました。 Bhakら（2006）は、牛のNTにおける卵子の活性化には、DMAPよりもCHXとイオノマイシンの併用が望ましいと結論づけています。 デヒドロロイコジン（DhL）は、ウシの卵母細胞およびSCNT再構成胚の化学的活性化剤として評価されました（Bhak et al.、2006年）。 さらに最近では、DhLがウシの卵母細胞およびSCNT再構成胚の化学的活性化剤として評価されました（Canel et al. 卵母細胞を低用量および高用量のイオノマイシンで活性化し、低用量および高用量のDhLに単独で、またはCBと交互に組み合わせて暴露した。 その結果、DhLはDMAPよりも体外受精で作られた胚に近い前核形成の動態を誘導し、低レベルのDhLは胚盤胞の発生を促進することが分かった。 これらの結果は、低レベルのDhL1とCBプロトコルへの長期暴露を組み合わせることで、SCNTプログラムに有用であることを示しています（Canel et al,
体外受精やNT後の胚盤胞形成は、卵胞摘出後約16時間でメタフェースIIに達した最初の卵母細胞を8時間後に授精させると、24時間で成熟した卵母細胞から得られた胚よりもはるかに高い頻度で胚盤胞を形成することが発見されたことにより、さらに促進されました（Dominko and First, 1997）。 早期に活性化できる高コンピテントの若い卵子を生産できることから、4〜6回の継代を経て培養、増殖、継代された胚盤胞内細胞塊から胚盤胞、妊娠、子孫を得ることができた（Firstら、1994；SimsとFirst、1994）。 効率は高くなく、NTの約15％が胚盤胞を産み、34回の胚移植で4頭の子牛が生まれました。 これらの子牛のDNAタイピングにより、その子牛が由来する細胞株と一致していることが確認された（Firstら、1994）。 老化した卵子モデルに切断期の胚盤胞やモルーラ細胞を使用した場合、NTの効率は高くなりました。 さらに最近では、Kwunら（2003）が、フルクトースとグルコースの組み合わせの存在下で、試験管内で培養した胚やNTで作製した胚が、より高い確率で正常胚盤胞期まで発育することを示した。 このグループは、SCNTに由来する移植可能な胚盤胞を大量に生産するためには、フルクトースがグルコースよりも効率的なエネルギー基質である可能性があると結論づけている(Kwun et al., 2003)。 マイクロニードルやエレクトロフュージョンではなく、細胞の核を核化した卵母細胞に融合させる方法としては、Rodríguezら（2008）が発表・検討したように、不活性化した融合ウイルスを用いて細胞の核を核化した卵母細胞に挿入する方法がある。 この方法では、除核した卵子の半分の殻にドナーの核を置き、その上に別の半分の卵子を融合させる。 その結果、ドナー核が成人体細胞由来の場合は65.7％、胎児細胞由来の場合は38.2％の卵子が胚盤胞になった（Rodríguez et al,
胚性細胞をドナーとした場合、核移植の20～50%が胚盤胞となり、牛に移植され、そのうちの約50%が妊娠します。 現在までにこの数は増加していますが、予想されるような急激な増加ではありません。 NTを成功させるには、ゲノムのインプリンティングとメチル化の状態を完全に消去し、ドナー細胞のゲノムを完全に再プログラムする必要があります。 再プログラムされたゲノムは発生過程で安定性を維持し、最終的には正常に分化した臓器を持つ生存可能な子孫を得なければならない。 リプログラミングには、凍結したドナー細胞、凍結保護剤を使用せずに凍結した臓器、および試験管内で成熟した卵子が使用されてきた（Stice and Keefer, 1993; Barnes et al, 1993）。 NTのうち、せいぜい20〜50％が牛に移植するための胚盤胞となり、そのうち約50％が妊娠しています。
商業企業は、胚クローンの効率を商業的な牛の生産に適したレベルとコストにまで改善しようと試みてきました。 残念ながら、十分なレベルの効率化には至っていません。 乳牛の場合、高乳生産牛の胚クローンを作るためには、乳生産までの飼育を行い、その後、高乳生産の胚クローン系統を選択する必要がありました。 胚性クローンの商業的な関心は、始原生殖細胞や胎児や成体の体細胞株からのクローン作成の出現により消えてしまいました。 しかし、ウシの胚性幹細胞を、遺伝子導入やトランスジェニックコロニーの選択に十分な数まで培養してから、NTを行う試みは今でも行われています（Mitalipovaら、2001年、Mertonら、2003年、Rodriguez-Martinez 2012年）。 最近では、誘導多能性幹細胞がウシの遺伝子改変動物やトランスジェニック育種のアプリケーションに使用されています(Cao et al., 2012; Han et al., 2011; Dong et al., 2007).
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