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結果

主流煙と副流煙を比較した21日間の吸入試験

INBIFOにおける副流煙の最初の研究、研究3047,13-16は、1981年11月に開始された21日間の吸入試験であった。 雄のSprague Dawleyラットを、同濃度（1リットルあたりの全粒子状物質（TPM）に基づく）の主流派タバコの煙、連邦取引委員会（FTC）のプロトコルにしたがってパフしたタバコの副流煙17、およびフリーバーニングタバコの副流煙に曝した14。

煙の濃度は170μg/l TPM（170 000μg/m3）で、これはINBIFOが以前に行った主流煙の吸入試験で決定された最大耐容量の約3分の1でした19,20。 各暴露群の20匹のラットは、1日7時間、21日間、煙にさらされました。 曝露方法は「頭部のみ」で，ラットは頭を先にして，頭の部分が煙の出るダクトに突き出た，ぴったりしたプラスチックチューブに入れられた。

コントロールとしては、通常のケージで飼育したラット（ケージコントロール）と、曝露管に入れて新鮮な空気を吸わせたラット（シャム曝露）を用意しました。

コントロールのラットは1匹も死亡せず、メインストリーム曝露群のラットは1匹死亡し、パフサイドストリーム群のラットは11匹死亡または衰弱死し、フリーバーニングサイドストリーム群のラットは12匹死亡または衰弱死しました14（表1）。 毎日の曝露終了時の平均体温は，シャム曝露ラットとケージコントロールラットが37°C，メインストリーム曝露ラットが36°C，サイドストリーム曝露ラットが32°Cであった14（表1）。 死亡率の増加は副流煙の方が急性毒性が強いことを示し、体温の低下は副流煙曝露ラットのショックと代謝機能の低下を示唆している21。

偽装およびケージコントロール群の呼吸回数は107回/分、メインストリーム暴露ラットは91回/分、サイドストリーム暴露ラットは86回/分であった。14 シャムおよびケージコントロール群は21日間の曝露中に体重が増加し、当初の体重の約150％に達し、主流派曝露群は当初の体重の130％に達し、側線曝露群は体重が減少し、当初の体重の80％にまで低下した14（表1）。 21

21日の暴露後、主流派の暴露ラットの6％に嗅覚上皮の軽度の萎縮が見られ、13％に鼻腔内の繊毛上皮の軽度の基底細胞過形成が見られた。 一方、サイドストリーム曝露ラットでは、嗅覚上皮の顕著な萎縮または潰瘍化、鼻腔内の繊毛上皮の過形成および扁平上皮化が見られ、一部に角化が見られた（表1）。 研究者たちはこう結論づけた。 “鼻腔の嗅覚上皮と繊毛上皮の上皮病変は、主流派よりも副流派の方が頻度が高く、重症であった。 14

1982年から1985年にかけて、主流煙と副流煙を比較する21日間の吸入試験が計7回行われた（3057,35-37 3061,20,22-24 3069,25-29 3081,30-33 3108,38 311339,40）。 これらの研究のうち4件（3057、3061、3069、3081）では、10％以上のラットを死亡させるのに十分な濃度の煙を使用していた（表1）。 体重減少と直腸温が33.5°C以下であることが死亡率と相関していた。

また、動物を扱った技術者は、タバコの煙の比較毒性の微妙な兆候を指摘しました。 3061試験では、380μg/lのTPM主流煙と90μg/lの副流煙を比較しました。 動物取扱業者は次のように述べています。 “タバコを吸ったラットは、毎日の曝露が終わると、全身に疲労感を示した。 翌朝まで回復した他のすべてのラットとは対照的に、サイドストリームを最も多く投与したグループのラットは、毛がボサボサになり、直腸温がわずかに低下した」24 これらの要因を総合的に判断して、3069および3081試験の統合報告書の著者は次のように述べている。 “主流派と高線量のサイドストリームに暴露されたグループはほぼ同様の反応を示したが、高線量のサイドストリームに暴露されたグループのTPM濃度は主流派に暴露されたグループよりも約4分の1低かった」25,41

呼吸器上皮の病理組織学的検査の結果は、サイドストリームの煙が1グラムあたり主流派の煙の4倍の毒性を持つという考えを裏付けるものである。 TPMに基づいて比較すると、鼻腔を覆う上皮の壊死を引き起こすのに十分なサイドストリーム煙の濃度は、主流煙の23％であった（表1）。

1982年3月、INBIFOの研究者は、主流煙と副流煙の凝縮物（インパクション・トラップで採取）を細菌の突然変異誘発試験で比較しました（306742）。 彼らは、S9ミクロソームと2種類のSalmonella typhimurium株、TA 98（フレームシフト変異を検出する）とTA 100（DNA塩基対置換を検出する）を用いて、プレート取り込みアッセイを行った。 TA 98株では差がなかったが、TA 100株ではサイドストリームコンデンセートで30％高い活性を示した。

腫瘍形成

1982年、サイドストリームの煙の凝縮物は、マウスの80週間の皮膚画腫瘍形成実験に含まれていました（306843-45）。 半分のマウスには7,12ジメチルベンズ(α)アントラセン(DMBA)の前処理を1回だけ行い、半分のマウスには前処理を行いませんでした。 DMBAのように、それだけで腫瘍を引き起こすのに十分な化合物を「腫瘍イニシエーター」と呼ぶ。 また、単独では腫瘍を発生させないが、腫瘍イニシエーターの後に適用すると腫瘍の発生率や多発性を高める化合物を腫瘍促進剤と呼ぶ。

酔いの兆候（必死の行動、うつ伏せの姿勢、パンティング、目を閉じる）は、サイドストリームで処理したマウスでより顕著に見られ、より長く持続した。 サイドストリームコンデンセートのみが用量依存性の死亡率を引き起こした45（表2）。 DMBAを投与しなかったマウスでは、サイドストリームコンデンセートを投与したマウスの方が主流コンデンセートを投与したマウスよりも腫瘍の発生率が3.4〜5倍高く（表2）、サイドストリームコンデンセートは主流コンデンセートよりもはるかに強力な腫瘍のイニシエーターであることが示唆された。 腫瘍発生までの時間、腫瘍の発生率、腫瘍の多さを考慮して、INBIFOの研究者たちは、DMBA処理をしていないサイドストリームコンデンセートは、主流のコンデンセートの2〜6倍の腫瘍誘発性があり、DMBA処理を先行して行ったサイドストリームコンデンセートは、主流のコンデンセートの2〜3倍の腫瘍誘発性があると結論づけた43。

急性毒性

最初の急性毒性研究（307146,47）では、主流派と副流派のたばこの煙の凝縮物を100～2115mg/kg体重の範囲でマウスに単回塗布して比較しました。48 凝縮液を塗布した後、マウスを2週間調査した。 副流煙の凝縮液のLD50濃度（動物の50％が死亡するのに十分な濃度）は608mg/kgであった。 主流のコンデンセートを塗った動物は試験中に50％の死亡率に達しなかったが，外挿されたLD50は2370mg/kgであった．

ヒトの肺組織培養細胞に対する毒性試験である3099研究47でも、主流煙と副流煙の毒性の違いが示された。 細胞をコンフルエントな単層に播種し、一晩付着させた後、新鮮な煙に曝しました49。煙は肺細胞と培養液の上の密閉された空域に様々な濃度で送り込まれ、一晩保持された後、フラスコから細胞を切り離し、翌朝、生存率を検査しました。 サイドストリームの煙のLD50は、メインストリームの煙の3分の1だった49。

1984年、副流煙の研究は、急性毒性影響や腫瘍形成から、特定の細胞タイプや細胞システムへの影響を調べることに変わり、副流煙を独特の刺激性にしている化学成分を特定し、副流煙を吸入しても観察不能な影響レベル (NOEL) を見つけることを目的としました。

白血球

3つの研究では、煙の吸入が肺内の白血球集団に及ぼす影響を検証しました（3108,38 3113,39,40 501550）。 主流煙と副流煙を吸入しても、これらの細胞には、呼吸器の上皮に与えるような顕著な違いはなかった。 両種の煙は、肺から回収した多形核白血球と肺胞マクロファージの数を増加させた38が、血液から回収した総白血球の数は減少させた39。主流煙を吸った動物の肺から回収したリンパ球は、副流煙を吸った動物の肺から回収したリンパ球よりもマイトジェン誘発増殖率がわずかに高かった50。 リンパ球の生存率の低下という知見は、副流煙に暴露された動物の免疫能力が主流煙に暴露された動物の免疫能力に比べて低下している可能性を示唆している51

副流煙の毒性強化の化学的根拠

主流煙と副流煙の違いの化学的根拠を調べた最初の研究では、副流煙とアンモニア蒸気をラットの1日吸入実験で比較した（310452-54）。 サイドストリーム煙にはメインストリーム煙の15～300倍のアンモニアが含まれている。 報告書3104の序文にはこう書かれています。 “52 13～253μg/l TPM の範囲で、5 種類の濃度の副流煙を試験した。 試験した5種類のアンモニア蒸気の濃度は、51μg/l（TPMサイドストリーム253μg/lのアンモニア程度）から414μg/l（TPMサイドストリーム253μg/lのアンモニアの約10倍）までの範囲でした。

最高濃度のサイドストリームを浴びたラット20匹のうち12匹が死亡しましたが、アンモニア投与群では1匹も死亡しませんでした。52 7時間の平均では、最高濃度のサイドストリーム投与群のラットの呼吸数は偽装対照群の半分以下でした。 52 サイドストリームの濃度が高いほど、ラットの体温は7時間の曝露中に37℃から30℃へと着実に低下したが、アンモニア群の体温は変化しなかったという。 INBIFOの科学者たちは、サイドストリームの煙は、それに含まれるアンモニア蒸気の10倍の刺激があると結論づけています52

506155研究は、3104研究のフォローアップです。 この研究では、副流煙に高濃度で含まれる5つの化学物質（ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アクロレイン、アンモニア、イソプレン）を3日間暴露し、ラットが吐き出す二酸化炭素の量を測定してその影響を検証した55。 呼吸数の減少と浅い呼吸は、感覚的な刺激に対する反応です56。この研究では、5つの化合物すべての組み合わせが、副流煙に含まれる濃度では、副流煙全体の10〜20％の刺激にしかならないことがわかりました55。

副流煙の毒性の化学的根拠を調べた次の研究（312457-61）では、副流煙全体、副流煙の粒子状相、副流煙のガスおよび蒸気相、および粒子状相とガスおよび蒸気相を組み合わせた副流煙の影響を比較しました。 ラットは1日7時間、3日間、それぞれの煙にさらされました。

最も刺激が強かったのは全層煙で、次いでガス/蒸気相、再結合煙相、最後に粒子相の順でした。 気体／蒸気相は、微粒子相よりも呼吸器を覆う上皮に対してはるかに強い影響を与えました60。気体／蒸気相にさらされた動物は、微粒子相にさらされた動物よりも過形成や変成の発生率が高かったのです60。 気体／蒸気相よりも微粒子相の方がダメージを受けた気道内の部位は、前喉頭のみであった60。これは、前喉頭がラットにおいて吸入された粒子の主要な衝突部位であるためであると考えられる62。

実験506263では、サイドストリーム全体の煙、サイドストリームのガス/蒸気相、およびサイドストリーム全体の煙に含まれる化合物の2倍の濃度のホルムアルデヒド、アクロレイン、アンモニアの混合物の上気道上皮への影響を比較しました。

実験312664-66では、2R1タバコの副流煙と、タバコ以外のタバコの副流煙、ニコチンを添加したタバコ以外のタバコの副流煙、および純粋なニコチン、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アクロレイン、アンモニアのエアロゾルを比較しました。

エンドポイントとして、体重増加、二酸化炭素（CO2）の呼気、気道の病理組織学を評価しました。 66 2R1の煙は最も体重増加を減少させ、次いでニコチンを添加したタバコ以外のタバコ、タバコ以外のタバコ、純粋なニコチンとアクロレインの順であった。 66 アクロレインエアロゾルは，呼吸器上皮の病理組織に及ぼす影響が，2R1煙の20～25％であった。64 喉頭では，最高濃度のアクロレインエアロゾルは，2R1煙とほぼ同程度の上皮の肥厚を引き起こした。

観察可能な影響レベル

1985年に始まった一連の実験は、異なる暴露方法を比較し、2～20μg/lのTPM濃度と3つの異なる煙暴露方法を用いて、新鮮な副流煙を短期間（21～90日）暴露した場合のNOELを求めることを目的としています。 311467,68の研究で使用された方法は頭部のみで、これまでのすべての実験で使用された標準的な方法であった。 312569と312770の研究では、鼻だけの暴露を行いました。 この方法では、より制限の厳しい曝露室が必要となり、動物へのストレスが大きくなりました。 鼻だけの曝露管に閉じ込められ、新鮮な空気を吸わせた偽曝露ラットの体重は、ケージコントロールのラットよりも20％少なかった。 312334,71-73の研究では、全身曝露を行った。

研究311467,68では、3、5、17μg/l TPMのサイドストリーム煙をテストしました。 ラットは2つのグループに分けられ、一方は3.5時間/日、もう一方は7時間/日、煙を浴びました。 また、煙を浴びた後に14日間の回復期間を設けて、その効果を検証しました。 その結果、INBIFOの科学者たちは、上気道の部位ごとに異なるNOELを提案しました。鼻の前の上皮の予備細胞の過形成が2μg/l、鼻の前の上皮の角化と嗅覚上皮の萎縮が17μg/l、声帯の上皮の過形成が2〜17μg/lと、声帯の正確な部位によって異なります（表3）。 21日間の吸入により観察された呼吸器上皮の変化は、14日間の回復後にすべて元に戻りました。

312334,71-73の研究では、全身暴露システムを使用して、高濃度のサイドストリーム煙（20および60μg/l TPM）の影響を測定しました。 煙の濃度を規定のレベルに維持する責任のある技術者が、煙がケージ内に放出される直前とケージ内から煙をサンプリングし、次のように気づいた。 “ケージ内の「実際の」濃度は、吸気口で測定した濃度よりも、TPMで0.8〜0.9、ニコチンで0.6〜0.8、アンモニアで0.3、ホルムアルデヒドで0.4〜0.5のファクターで低くなっていた。

312569（21日）および312770（90日）の研究では、2μg/lおよび6μg/lのTPMを鼻だけで暴露しました。 21日間の試験では、どちらの濃度でも鼻上皮の過形成は起こらなかったが、6μg/lの濃度では声帯の過形成とわずかな変成が起こり（表3）、体重増加も低濃度群で12％、高濃度群で24％減少した74。 6μg/l TPMを90日間投与した場合、声帯に著しい変成が見られた。 どちらの濃度でも、21日後70よりも90日後の方が呼吸器上皮の損傷が激しく、より多く見られた（表4）ことから、副流煙に長くさらされると、呼吸器に深刻な損傷が生じることがわかる。