Abstract
多くの患者は手術後に優れた身体的回復を遂げますが、中には気分の変動、さらにはうつ病に悩まされる患者もいます。 術後うつは、手術中の認知機能障害や痛み、免疫力の低下などが原因と考えられる。 しかし、全身麻酔がうつ病の発症に関与している可能性も高いと考えられます。 我々は、最も使用されている麻酔薬の1つであるプロポフォールをマウスモデルに使用し、この静脈麻酔薬がマウスに抑うつ的な行動を引き起こすかどうかを調べた。 その結果、プロポフォールを単回投与すると、尾部懸垂試験、強制水泳試験、オープンフィールド試験において、有意な行動異常を引き起こすことがわかりました。 また、これらのマウスの脳切片を調べたところ、CD11bタンパク質の発現が有意に減少しており、プロポフォールがミクログリア機能を阻害していることが明らかになりました。 また、シナプス蛋白質であるSYPに対するプロポフォールの影響を調べたところ、蛋白質の発現には目立った影響は見られなかった。 以上の結果から、プロポフォールの投与は、ミクログリア細胞の機能に影響を与えることで、マウスの抑うつ様行動を促進する可能性が示唆された。 さらに、脳組織においてIL-6サイトカインが有意に増加しており、これが転写因子であるSTAT3の活性化を引き起こしている可能性があることもわかった。 今回の発見は、麻酔薬のメカニズムをさらに理解し、術後うつ病の根本的なメカニズムを解読するための新たな視点を提供するものであると考えられます。 はじめに
全身麻酔や手術を受けた患者の多くは、特に侵襲的な手術を受けた後の6ヶ月間は、何らかの形で術後うつを経験します。 手術後の頻発する合併症の1つとして、うつ病は、特に高齢の患者の場合、さらなる罹患率や死亡率につながる可能性があります。 一方、研究者たちは、うつ状態の患者が手術後に他の合併症を起こしやすいことを発見しました。 うつ病の患者さんは、リハビリテーションなどの術後のケアにおいて、介護者との連携がうまくとれません。 また、すでにうつ病や不安神経症の既往がある患者さんでは、術後のうつ病からの回復に時間がかかると言われています。 また、ある研究では、手術が既存のうつ病の重症度を悪化させる可能性が示唆されています。 これまでのところ、手術とうつ病の間になぜこのような強い関連性があるのかについては、ほとんど分かっていません。 研究者の中には、多くの人が手術後にうつ状態になるのは、手術によって自分の死を直視せざるを得なくなるからだという心理的な理由を考えている人もいる。 また、脳外科手術、人工股関節置換手術、がん切除手術などの大きな手術では、うつ病が多く見られることから、手術の種類が術後うつ病の誘発に影響すると強調する研究もありました。 しかし、最近の研究では、麻酔をかけている時間の長さが、うつ病の起こりやすさや重さに関係しているようだと示唆されている。 プロポフォールは、手術後の集中治療室で最も使用される麻酔薬の1つである。 プロポフォール投与は、術後の認知機能障害と有意に関連することがわかっている。 これまでに、プロポフォールが患者や動物の気分状態にどのような影響を与えるかを検討した例はありません。 そこで私たちは、プロポフォールを単回投与したマウスモデルを用いて、鬱病様の行動を検証しました。 その結果、プロポフォールを単回投与したマウスは、プロポフォールを投与していないコントロールマウスと比較して、オープンフィールドテストでは中心部にいる時間が短くなるなど不安様行動を示し、尾懸りテストおよび強制水泳テストでは無動時間が長くなるなど抑うつ様行動を示した。
2.材料と方法
2.1. 動物と薬物治療
本研究では、8-10週齢の雄のC57BL/6マウスを使用した。 すべてのマウスは水と餌に自由にアクセスできた。 ここでのすべての動物実験において、マウスは中国動物愛護委員会によって確立されたガイドラインに従って厳密に扱われた。 すべての手順は，中国山東省の青島市立病院の動物管理委員会によって承認された。 マウスは，通常の生理食塩水（コントロール）とプロポフォール（75 mg/kg）の2つのグループに分けられた。 プロポフォールの単回投与の注射をマウスの腹腔内に投与した。 ここでは市販のプロポフォール注射液（Xi’an Libang Pharmaceuticals, China）を使用した。 ここで使用したプロポフォールの用量は、以前の研究から採用したものである。 麻酔時間中、すべてのマウスは体温を維持するためにヒーティングパッドの上に置かれた。
2.2.
2.2.オープンフィールド
オープンフィールド試験には正方形の木箱を使用した。 試験開始時、各マウスは箱の隅に壁に向かって置かれた。 全マウスの総移動距離と内側の四角の中で過ごした総時間を記録し、5分間で測定した。
2.3. 尾部懸垂試験
尾部懸垂試験については、既報の通りの手順で行った。 マウスは小さな金属製のフックにテープで尾から吊るされ、この位置では逃げたり近くの表面につかまったりすることができない。 6分間の試験期間中にマウスが動かなかった時間の合計を記録した。 無動とは、マウスが体を動かそうとしないことと定義した。
2.4. 強制水泳試験
既報の通り、強制水泳試験を行った。 室温で水を入れたガラスビーカーにマウスを入れた。 15分間のテストセッションでマウスの総不動時間をテストし、最後の6分間を不動時間として採点した。 各試験の終了時には、濡れたマウスを乾いたタオルで温めた後、直ちに通常の寝具を備えたケージに入れた。
2.5. 高架式プラス迷路試験
高架式プラス迷路は、動物の不安反応を評価する簡便な方法である。 私たちは、既報の通り、高架式プラス迷路アッセイを用いてマウスの不安レベルをテストしました。 高架式十字迷路は、2本の開いた腕と2本の閉じた腕を持ち、地面から約50cmの高さに設置されています。 各試験の開始時に、マウスは開いたアームに向かって中央の広場に置かれ、その後5分間アームを探索させました。 開いた腕の中で過ごした時間を記録し、実験デザインに関与していない人が分析しました。
2.6. 酵素結合免疫吸着法（ELISA）
市販のELISAキット（eBioscience, Thermo Fisher Scientific）を用いて、脳組織中のIL-6濃度を測定した。 各サンプルは、相対的な発光単位が標準曲線の線形範囲内に収まるように、適切な希釈を行って二重に測定した。 各サンプルのIL-6の値を正規化し、総負荷タンパク質と比較した比率を相対的な比率として表した。 各サンプルの吸光度は、マイクロプレートリーダー（Synergy Mx, BioTek, Winooski, VT）を用いて測定した。
2.7. Western Blot
溶解した脳サンプルを処理し、SDS-PAGEゲル上で走らせた。 その後、PVDF膜に転写し、TBST緩衝液中の5%スキムミルクでブロックした。 ブロッキングした膜を、CD11b（1 : 4000; 英国Abcam社）、シナプトフィジン（SYP）、p-Stat-3（1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA）、total Stat-3（1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA）に対する抗体を用いて、4℃で一晩、TBSTミルク中でさらに調べた。 二次抗体とそれぞれ室温で2時間インキュベートした後、膜上のタンパク質のバンドを化学発光反応で開示した。 内部コントロールとしてβ-Actinを用いた（1：5000；Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）。 定量的な結果は、各標的タンパク質のβ-アクチンに対する比で表した。
2.8. 統計解析
本研究で示された値は、. 2群間の差の有意性をStudent’s -test解析で判定した。 0.05未満の値は、統計的に有意であるとみなされました。
3.結果
3.1. プロポフォールの単回投与はマウスの尾部懸垂および強制水泳試験で抑うつ様行動を引き起こす
まず、プロポフォールの単回投与がマウスの行動パフォーマンスに長期的な影響を与えるかどうかを、抑うつ様行動に注目して仮説を立てて検証した。 プロポフォールの長期的な影響を調べるために、これらのマウスに尾部懸垂試験と強制水泳試験を採用した。 尾部懸垂試験では、プロポフォールを投与したマウスを尾部で吊るしたときに、プロポフォールを投与していない対照マウスに比べて不動時間が有意に増加したことがわかった（図1）。 さらに、プロポフォールを投与したマウスの抑うつ的な行動を確認するために、力泳法を用いてこれらのマウスの不動時間を測定した。 その結果、プロポフォールは対照群のマウスに比べて不動時間の合計が増加することが明らかになった（図2）。 以上の結果から、プロポフォールを単回投与することで、マウスの長期的な抑うつ行動パフォーマンスを引き起こし、持続させることができることが明らかになりました。
3.2. 単回投与のプロポフォール曝露は、マウスのOpen FieldテストとElevated Plus Mazeテストで不安様行動を引き起こした
不安は、うつ病で最も高い併発性合併症である。 そこで、これらのマウスにおける上記の行動結果に基づいて、プロポフォールがこれらのマウスに不安様行動を誘発するのではないかと仮定した。 これらのマウスの不安レベルをテストするためにopen field assayを使用した。 図3（a）に示すように、プロポフォールの投与により、オープンフィールドでマウスが中央のエリアに滞在する総時間が効果的に減少した。 さらに、この試験のもう1つの重要なパラメータである、マウスの総移動距離も測定しました。 予想通り、プロポフォールを注射すると、コントロールマウスに比べて、5分間のテストセッションにおけるマウスの移動距離が有意に減少しました（図3（b））。 次に、これらのマウスの不安感に似た行動を高架式プラス迷路アッセイで調べた。 その結果、プロポフォールを投与したマウスでは、open armにいる時間が有意に短くなり（図4）、open field testの結果と一致しました。
(a)
(b)
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3.3. 単回のプロポフォール投与でマウスの脳組織におけるIL-6のレベルが上昇した
最近の研究では、術後せん妄様の認知障害に神経炎症が関与していることが示唆されている。 私たちは、プロポフォールがこれらのマウスの脳組織におけるIL-6の発現レベルに影響を与えるかどうかを検証しました。 そこで、プロポフォールを投与したマウスと投与しなかったマウスの脳組織（海馬と大脳皮質）において、ELISA法を用いてIL-6の発現量を評価した。 その結果、この条件でプロポフォールを投与すると、プロポフォールにさらされたマウスの脳内で、このサイトカインの発現レベルをアップレギュレートできる可能性があることがわかった（図5）。 この結果は、プロポフォールがマウスの脳内の炎症反応に影響を与えることで、不安や抑うつのような行動を引き起こす可能性を示しています。
3.4. マウスの脳組織におけるCD11bの発現低下とp-STAT-3の発現増加は、プロポフォールの単回投与が原因だった
最後に、プロポフォールを投与したマウスの行動変化の原因と考えられる細胞および分子メカニズムを調べました。 ミクログリアのメーカータンパク質であるCD11bを調べることで、グリア細胞がプロポフォール処理の影響を受けているかどうかを検証しました。 ウェスタンブロット法で調べたところ、プロポフォールを投与したマウスの脳ではCD11bの発現量が減少しており（図6（a））、プロポフォールの投与によってミクログリアの機能が制御されている可能性が示唆された。 一方、シナプス前のタンパク質であるSYPの発現は、プロポフォール処理によって影響を受けなかった（図6（c））。 また、転写因子であるSTAT-3の機能を調べるために、STAT-3のリン酸化状態（p-STAT-3）を調べた。 ウェスタンブロットの結果、プロポフォール投与により、全STAT-3の発現に影響を与えることなく、p-STAT-3の発現レベルが上昇することが明らかになった（図6（b））。 これらの結果は、プロポフォールがミクログリア細胞の機能に影響を与え、STAT-3のリン酸化を亢進させながら、マウスの不安・抑うつ様行動を誘発することを示唆している。
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(c)
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4.考察
認知機能や記憶機能の障害についてはかなり研究されていますが、術後の気分の変動についてはこれまであまり注目されていませんでした。 いくつかの証拠は、手術や麻酔治療にさらされた患者に起こる重大な気分の変化があるという考えを支持していた。 ここでは、手術を伴わずに単回の麻酔薬投与を受けた動物を対象に、麻酔薬投与そのものが気分状態に大きな影響を与えるのではないかという新しい仮説を検証した。 代表的な麻酔薬としてプロポフォールを使用し，マウスに腹腔内注射した。 その後、マウスの気分の変化を観察するために、一連の抑うつ行動と不安行動を行いました。 その結果、プロポフォールを投与した場合としなかった場合では、これらのマウスの行動パフォーマンスに有意な差があることがわかった。
神経炎症は、中枢神経系における抑うつやその他の気分の変化に寄与する主要な要因の一つであることがわかっています。
神経炎症は、うつ病やその他の中枢神経系における気分の変化の主要な要因の一つであることがわかっています。 ミクログリア細胞の活性化を示す一般的なマーカータンパク質の一つであるCD11bをウエスタンブロットで調べました。 意外にも、プロポフォールはCD11bのタンパク質レベルを抑制することがわかった。 これは、ミクログリアの活性化の有無にかかわらず、プロポフォールがCD11bの蛋白質発現を抑制することができたためと考えられる。 このようなプロポフォールの作用は、外傷、脳卒中、多発性硬化症などの中枢神経系の病態において、ミクログリアの過剰活性化を抑制する治療法として重要であると考えられる。 また、動物の行動を支える重要な基本因子であるシナプスタンパク質に対するプロポフォールの影響についても調べた。 興味深いことに、プロポフォールはミクログリア細胞の機能には影響を与えるものの、シナプスタンパク質の発現レベルには影響を与えないようでした。 これらの知見は、いくつかの先行研究と一致しない。 これは、プロポフォールを投与した後にタンパク質を採取した時間帯が異なっていたためと考えられる。 しかし、今回の結果は、プロポフォールが神経細胞と他のグリア細胞に異なる影響を与える可能性を示唆している。
プロポフォールの単回投与による中枢神経系の神経炎症反応は、IL-6のELISAテストによってさらに検証された。 その結果、プロポフォールの投与により、マウスの脳内でIL-6のアップレギュレーションが誘発されることがわかった。 これらの知見は、プロポフォールがミクログリア細胞の機能に及ぼす影響と一致していた。
今回の研究では、プロポフォールがミクログリア細胞の機能に影響を与え、中枢神経系における炎症反応を悪化させることが示唆された。
今回の研究では、プロポフォールがミクログリア細胞の機能に影響を与え、中枢神経系の炎症反応を悪化させることが示唆されました。 今回の研究では、手術後の気分の変化に麻酔薬が重要な役割を果たしていることが強調されたが、手術中や手術後の患者によく見られる炎症など、多くの要因によって気分が大きく影響を受ける可能性がある。
Data Availability
本研究の結果を裏付けるために使用されたデータは、リクエストに応じて対応する著者から入手可能です。
Conflicts of Interest
すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、中国山東省青島市の青島市立病院整形外科からの資金援助と、中国濰坊市の濰坊医科大学からの技術支援に感謝します。