共焦点顕微鏡は、3D蛍光顕微鏡の一種で、ピンホール半径を持つピンホールを使用することにより、ピンホール内の光を除去して解像度を高めたものです。 これは、特定のピンホール半径を持つピンホールを使用することで行われ、本質的な3D顕微鏡となります。共焦点顕微鏡の焦点の性質により、空間の異なるポイントでの強度の集まりとして3D画像を得ることに特に適しています。
共焦点画像は、Huygens Confocal Optical OptionによるHuygens Deconvolutionに非常に適していますが、主な理由は2つあります。
共焦点顕微鏡では、ナイキストレートが広視野顕微鏡の約半分になります。
共焦点顕微鏡の仕組み
生体システムは一般的に3次元構造です。 従来の広視野顕微鏡のように、蛍光体で標識されたサンプルに励起レーザー光を照射すると、得られる画像は通常、焦点の合っていない蛍光光によって大きく乱されます。 これは、画像のぼやけにつながり、コントラストが著しく低下する。 共焦点顕微鏡は、この不要なピンボケ光を低減する技術である。 この技術では、励起光をサンプルにしっかりと集光します。 焦点からの発光光は、同じ対物レンズで集められた後、小さなピンホールから集光され、光検出器に向けられます（図1（a））。 焦点の合っていない発光光は、ピンホールによってほぼ遮断されます（図1（b））。 この方法では、焦点領域からの光だけが検出器に到達することができます。 これは、焦点面の他の場所からの光も遮断されてしまうという欠点である。共焦点顕微鏡は、点で励起し、点で検出するものである。 共焦点顕微鏡は、点で励起し、点で検出する手法である。解決策の一つとして、サンプルを1点ずつラスタースキャンして、焦点面からの蛍光信号のみを集めた完全な画像を再構成する方法がある。
また、スピニングディスク顕微鏡のように、複数の励起スポットを並行してスキャンすることも可能です。
STEDは、実質的には点走査型共焦点顕微鏡の延長線上にあります。 STEDは、点走査型の共焦点顕微鏡の延長線上にあります。誘導放出に必要な高い強度を得るためには、STEDビームをサンプル内に収束させる必要がありますが、一方で、点状に検出することで、焦点外の光を減らすことができます。 STEDを機能させるためには、ドーナツ型の焦点の励起焦点中心とSTED強度のヌルが完全に重なる必要がある。 そして、ピエゾ走査ステージなどを用いてサンプルをラスタースキャンすることで画像を得ることができる。
共焦点画像のデコンボリューション
共焦点画像にデコンボリューションを適用することで、x、y、z方向の解像度が向上し、ノイズから回復します。 そのため、画像の視覚化と分析が容易になります。 共焦点のデフォルトのアルゴリズムはクラシック最尤推定（CMLE）で、デフォルトのSNR値は20です。 デフォルトのパラメータでスタートし、デコンボリューションの結果を最適化するために、他のSNR値を検討することなどをお勧めします。 SNRは、元の画像を説明するパラメータとしてではなく、デコンボリューションの結果を制御する調整可能なパラメータとして考えるべきです。 ノイズの多いオリジナル画像を復元する際に、SNR値を大きくしすぎると、ノイズが強調されてしまう可能性があり、危険です。 ノイズの多い共焦点画像では、SNR値が20以下になることもあります。 また、Good’s roughness Maximum Likelihood Estimation（GMLE）アルゴリズムをテストして、結果を改善するという方法もあります。
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Remko R.M. Dijkstra, Design and realize of a CW-STED super-resolution microscope setup, Master Thesis , University of Twente, 2012