Results
Overall Structure of E. coli Ivy Protein .
ykfE遺伝子がコードするタンパク質は、機能未知の大腸菌遺伝子を対象とした構造ゲノミクスプロジェクトの一環として発現・精製されたものである。 その結果、YkfEタンパク質は、通常の菌体破砕法で使用されるHEWLと共重合し、共結晶することが偶然にも発見された。 その後、YkfEタンパク質は、C型リゾチームを強力かつ特異的に阻害することが明らかになり(7)、この特性を反映して遺伝子名がIvy (inhibitor of vertebrate lysozyme)に変更された。 大腸菌Ivy（Ivyc）の単離およびリゾチームとの複合体の高分解能結晶構造が得られている。
Ivyc構造のステレオビュー。 a）IvycモノマーのCαトレース（残基2-128）。 (b)Ivyc二量体のリボン構造
Ivycの構造。 (a)Ivyc-HEWL複合体の漫画表現。 Ivyc二量体のモノマーは青と赤に、2つのリゾチーム分子はオレンジに着色されている。 HEWLを阻害するIvycのH60残基は水色の球と棒で表されている。 HEWLのD52残基は黄色で、E35は紫色でボールと棒で表現されている。 これらの2つの残基はHEWL活性サイトの一部であり、Ivyc H60残基と水素結合を作る。 黒い矢印は、Ivyc二量体と各リゾチーム分子の間の表面接触領域を示している。 (b) 複合体構造のIvy分子（赤とピンク）と、孤立した3つのIvyc分子（黄、青、紫）を、複合体から取り出した1つのIvyc分子（赤）と重ね合わせた漫画表現。 二次構造要素は構造体に記されている。 (c)HEWLの活性部位を貫通するIvycの突出したループの電子密度マップを立体的に示したもの。 2つのF o – F c電子密度マップは、1.0σで輪郭が描かれている。 残基は種類別に色分けされており、塩基性残基はシアン、酸性残基は赤、極性残基は薄緑、疎水性残基は黄、システイン残基は緑、芳香族残基は紫である。 Ivyc H60とHEWL E35およびD52はラベルされている。 (d)Ivycループ（CKPHDC）とリゾチーム活性部位との相互作用。 Ivycは青いリボン、H60、C57、C62は黄色いボールと棒、分子表面としてのリゾチーム活性部位は残基の種類に応じて着色されている（酸性、赤、極性、緑、疎水性、白、塩基性、青）。
構造の説明
我々はこれまでに、ペリプラズムのIvycホモダイマーが生理活性ユニットであり、二量化K dが10-9Mの範囲にあることをゲルろ過と蛍光の研究で明らかにした(7)。 Ivycタンパク質は二量体として結晶化した。 結晶の非対称単位には、非結晶性の二量体と単量体に相当する3つの分子が含まれている。 この単量体は、結晶学的対称性を適用することで、生理的な二量体を再構成する。 各単量体は、5本の逆平行なβストランドからなる中央のβシートが、凸側に2本の短いヘリックス（α1, α2; それぞれ6残基と8残基）、凹側に1本の両親媒性ヘリックス（α4; 11残基）で挟まれている（図1）。 我々は、DALIプログラム(8)を用いて、このドメインの構造的相同性を検索した。 PDBで最もよく一致したのは、酵母由来の306aaのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（PDBコード1BOB）であり（Z = 5.2）、89アミノ酸のうち9％しか同じ残基がなく、rmsdは4.0Åであった。 二量体構造は、2つの逆平行な両親媒性ヘリックス（α4）を中心とした馬蹄形の折り畳みを示す（図1 b）。 結晶中では、結晶学的な2回軸で結ばれた2つのモノマー（モノマーA）の間に1,605Å2、非結晶学的な2回軸で結ばれた2つのモノマー（モノマーB、C）の間に1,432Å2の埋もれた表面積がある。 3つのモノマー間のrmsdは、Cα重ね合わせにより、122残基にわたって0.547Å（B/C）から0.865Å（A/B）の範囲となった。 この構造から、二量体は、β6鎖、α4およびα5らせんのC末端部分に集まった残基のバックボーンと側鎖の間で相互作用していることが明らかになった（Fig.2 b）。 これらの残基は、様々な大腸菌株、Shigella flexneri、Klebsiella pneumoniae、Burkholderia cepaciaのホモログ配列に保存されていることから、Ivyタンパク質はこれらの細菌では機能的な二量体であり、他のIvyを含む細菌ではおそらく単量体であると考えられる。 Ivyc-HEWL複合体構造 (PDB Code 1GPQ).
結晶非対称単位には、1つの非結晶性のIvycのホモダイマーと2分子のHEWLが複合している。 Ivyc/HEWLの相互作用には2種類あり、1つのIvycモノマーと1つのHEWL分子の間に969Å2の埋もれた表面積を伴う主な相互作用と、2つ目のIvycモノマーと同じHEWL分子の間に552Å2の埋もれた表面積を伴う副次的な相互作用があり、結果的にIvycホモダイマーと1つ目のHEWL分子の間に1,340Å2の埋もれた表面積が形成される（図2 a）。
この複合体の構造は、実験的に得られたIvycとHEWLの相互作用の確率（7）を裏付けるものであり、Ivyc分子がリゾチームを阻害するメカニズムを即座に示唆するものである。 Ivyc/HEWL複合体の形成により、リゾチームの活性部位は、Ivyc分子から突き出たループによって塞がれる（図2 cおよびd）。 このループの中心にあるヒスチジン残基（H60）は、リゾチームの酵素活性を担う3つの残基のうち、2つの残基（D52とE35）と水素結合する。 Ivycと複合体を形成したリゾチーム分子は、大きな構造変化を示さない（1HELとリゾチーム分子を結晶中でCα重ね合わせた結果、127残基にわたってrmsd≒0.5Å）。
Ivycの単独およびHEWLとの複合体の精密構造を比較すると（図2bおよびSI Table 2）、いくつかの小さな構造変化が見られる。 その中には、遊離型Ivycの3つのモノマーにおける小さなヘリックス（α3）の向きが含まれている。 分子Aで観察された配向は、HEWLと複合体を形成したIvyc二量体で観察された配向に最も近い。 Ivyc/HEWL構造に見られる3つの310ヘリックス（η1、η2、η3）は、非複合体の3つのIvy分子には存在しない。 さらに驚くべきことに、リゾチームの活性部位と直接相互作用するIvyループの突出部は、2つの結晶形態の間で顕著な構造変化を示さない。 このやや短いループが硬直しているのは、1番目のシステインの隣にあるリジン残基（K58）と2番目のシステインの隣にあるアスパラギン酸残基（D61）の間にジスルフィド結合（C57-C62）と塩橋が存在するためであると考えられる。 これらの構造上の制約は、C型リゾチームとのキーロック型の相互作用を示唆しており、遠縁のバクテリアであっても、Ivyのホモログのサブセット（Ivyc orthologues）間でループ配列が厳密に保存されていることの説明になるかもしれない（図3およびSI図5）。
Ivyタンパク質ファミリーの系統樹解析。 系統樹では、Ivycの祖先はガンマ部とベータ部の両方に存在していたが（黄色）、その後、ガンマ部（サルモネラなど）とベータ部の一部のクラッド（ほとんどのナイセリア科やボルデテラなど）で失われたことが示唆されている。 Ivyが確認された少数のα種（赤）につながる枝の位置が異常であることから、おそらくB. cepaciaの場合（Burkholderia由来の遺伝子の消失、腸内細菌からの獲得）と同様に、腸内細菌からの水平移動による獲得が強く示唆される。
Functional Studies: ΔIvyの大腸菌変異体の特性解析
阻害におけるCKPHDCループの中心的な役割は、指向性変異導入により実験的に検証されました。 また、Ivyc/HEWL複合体の構造から示唆された主要な相互作用残基のいくつかの影響を評価するために、アミノ酸置換を行った。 その結果、予想通り、ヒスチジン（H60）変異体の阻害活性が低いことがわかった。 最も劇的な効果（K iの300倍の増加）は、この位置に負電荷を帯びたアスパラギン残基を導入した場合に見られた（SI Table 3）。 この効果は、リゾチーム活性サイトの2つの酸性残基（D52およびE35）との反発的な相互作用によって引き起こされる可能性が高い。 一方、ジスルフィド結合を破壊するC62→A62変異を導入しても、阻害活性に大きな変化は見られなかった。
リゾチーム存在下でのIvyタンパク質のin vivo保護効果を評価するために、大腸菌のivy遺伝子のノックアウトを行った。 大腸菌の単独のivy遺伝子ノックアウトでは、HEWLに対する感受性が高まるという表現型は見られず、実験室の条件では、リゾチームは細菌の壁を貫通しないことが確認された(9)。 次に、先に述べた「多孔質細胞壁」の表現型を再現するために、TolB-pal欠失を導入した二重変異体を構築した（10）。 大腸菌のΔtolB変異体は、エンベロープの合成が損なわれているため、薬剤や洗剤に対する感受性、漏出性、外膜ベシクル形成といった典型的な表現型を示すことが以前に示されている（10, 11）。 我々は、ΔtolBΔivy二重変異体のリゾチームに対する感受性を、ΔtolB変異体（JC864）を基準にして測定した。 実験室条件では、ΔtolB変異体は分泌物中に見られる濃度（>50μg-ml-1; SI Fig.6）よりも高い濃度のリゾチームに感受性を示すことがわかり、小分子に加えてタンパク質サイズの分子もこのような漏出大腸菌細胞に浸透することができることが示された。 次にΔtolBΔivy変異体を調べたところ、HEWLに対してより高い感受性を示すことがわかった。というのも、生理的な濃度（50μg-ml-1；図4 a）では、細菌の成長に対するリゾチーム効果がすでに見られ、Ivycの保護的な役割が支持されたからである。 この保護作用は、イソプロピルβ-d-チオガラクトシド誘導性発現プラスミドを導入したΔtolBΔivy二重変異体でIvycを過剰発現させることでさらに確認され（図4b）、500μg-ml-1までのリゾチーム濃度でIvyの発現が細菌の生育を回復させることができた。 同様の結果は、他の透過性処理の場合にも記述されています(9)。
HEWLの濃度上昇がE. coli変異体の増殖速度に及ぼす影響。 a）E. coli MG1655 ΔtolBΔivy。 (b) ペリプラスムにIvycタンパク質を発現するpET26プラスミドを導入して形質転換した大腸菌MG1655 ΔtolBΔivy。 コントロールとしてのE. coli MG1655 ΔtolB（JC864）については、SI図6を参照。
大腸菌のIvyタンパク質のホモログは、バクテリアの完全なゲノム配列や、すべての主要なゲノム配列決定センターからの進行中の配列決定プロジェクトのデータなど、一般にアクセス可能なすべての配列データを用いて徹底的に検索しました（材料と方法を参照）。 同定されたすべてのIvy相同配列は、より進化的に遠い親戚の検出を最適化するために、クエリとして繰り返し使用された。 その結果、35の異なるIvy類似配列が同定された（E. coli K12 Ivyタンパク質との配列同一性は100%から25%の範囲）。 驚くべきことに、アイビーのホモログはプロテオバクテリア（グラム陰性菌）のメンバーにしか確認されておらず、そのすべてがペリプラスムであることが予測されている（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）。 一方では、Ivyタンパク質がペリプラスム区画内でプロテオグリカン部分（リゾチーム基質）と共局在することは論理的に見えるかもしれません。 一方、プロテオグリカンネットワークは、プロテオバクテリアの細胞壁によって外来酵素の攻撃から物理的に守られていると考えられており、リゾチームの天然の基質ではないと考えられている。 グラム陽性菌ではなくグラム陰性菌にリゾチーム阻害剤をコードする遺伝子が存在するのは、このようにパラドックスである。 図3は、アイビーのホモログの系統樹を、標準的なプロテオバクテリアの区分（12）であるアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロンに従って示したものである。 現在のところ、アイビー蛋白質ファミリーはガンマおよびベータ部門で最もよく知られているが、アルファ部門の無関係な2つの種から2つのアイビー相同遺伝子が明確に同定された。 アルファ部門では、Parococcus denitrificansとGluconobacter oxydansの2種にアイビーのホモログが確認されている。 一方、ガンマ・ベータ区分では、アイビーの同族体は散在している。 例えば、Ivyのホモログは、サルモネラを除くすべての腸内細菌に存在するが、配列が明らかになっているすべてのシュードモナデシコにも存在する。 同様にβ部門でも、Ivy相同遺伝子はすべてのBurkholderiaに見られ、Neisseriaceaeの1種に同定されているが、この部門の他の多くのシークエンスされたゲノムには存在していない。 このようなIvyタンパク質ファミリーの散在的な分布は、詳細な系統解析で示唆されているように、クレード間の差動的な遺伝子損失と水平移動のイベントが重なった複雑な進化の歴史を示している（図3）。
Ivy ファミリー ホモログ ファミリー ホモログ ホモログ ファミリー ホモログ ホモログ ファミリー ホモログ ホモログ ホモログ 。 このモチーフは、HEWL/Ivyc複合体の立体構造やIvycループ変異体の機能研究で同定されたリゾチーム阻害ループと正確に一致する（前述）。 これらのデータに基づき、このループ配列を示すIvy相同体を、大腸菌ivy遺伝子の正真正銘のオルソログ（すなわち、それぞれの種においてリゾチーム阻害剤であり、同じ機能を果たすことが予測されるもの）として分類した。 さらに、Burkordelia cepacia Ivyの配列ではアスパラギン残基がアスパラギン残基に置換され（Ivycとの同一性は48％）、Gluconobacter oxydans 621H Ivyの配列ではリジン残基がアルギニン残基に置換されている（Ivycとの同一性は26％）など、ループがほぼ正確に保存されている2つのオルソログ配列がある。 これらの変異をIvyc/HEWL複合体の立体構造と照らし合わせて分析した結果、これらの変異はいずれもリゾチーム/アイビーの適切な相互作用、ひいてはリゾチームの阻害に適合するはずであることが示唆された。 次に、非正規のループ配列を持つ残りの5つのIvy相同体を、大腸菌のIvyパラログ（異なる機能を果たすと予測されるもの）と呼んだ（SI図5b）。 アイビーパラログは、Pseudomonas属の種の中でのみ見られる。 P. aeruginosa、P. syringae、P. putida、P. fluorescensといったPseudomonas属の種の中にのみIvyのパラログが存在しており、これらの種のCExxDxCループ配列は関連しているが、異なっている。 さらに、P. aeruginosaは、Ivyのオルソログとパラログの両方のバージョンを持つ唯一の種である。 P. aeruginosaのIvyオルソログ配列は、P. aeruginosaのIvyパラログ配列にも最も類似していることから、Ivyパラログの非正規ループにつながる遺伝子重複が、Pseudomonadaceaeにつながる枝に沿って起こったことが強く示唆された。
P. aeruginosa Ivy Homologuesの発現と機能的特性
Ivyのオルソログとパラログの形態に関する機能的予測を検証するために、P. aeruginosa Ivy関連遺伝子の産物を発現させた（材料と方法を参照）。 その結果、Ivyp1（オルソログ）とIvyp2（パラログ）と呼ばれる2つのタンパク質が精製され、HEWLに対する阻害活性が確認された。 それぞれのループ配列から予測されるように、Ivyp1（CKPHDC）タンパク質はリゾチーム活性を阻害するが、Ivyp2（CEKSDC）は阻害しないことがわかった。 Ivyp1がHEWL活性を阻害した結果をSI Fig.7aに示す。
Structure of P. aeruginosa Ivyp1 (PDB Code 1UUZ).
P. aeruginosa Ivyp1とE. coli Ivyが同様の抗リゾチーム活性を示すことが示された後、P. aeruginosa Ivyp1はE. coli Ivyと同様の抗リゾチーム活性を示すことが示されました。
P. aeruginosa Ivyp1とE. coli Ivyが同様の抗リゾチーム活性を示すことが明らかになった後、Ivyp1とHEWLの複合体の構造を決定し、これら2つのIvyタンパク質の配列が遠隔地で類似しているにもかかわらず（30%の同一残基；SI図5a）、阻害的な相互作用がどのように維持されているかを可視化した。 予想通り、Ivyp1の構造はIvycモノマーの構造と似ている。
このような大きな違いがあるにもかかわらず、2つのIvyホモログのリゾチーム分子との相互作用は驚くほど似ている（図2、SI図7b、SI表4）。 Ivyp1とIvycのモノマー間のCα rmsdは約2.8Åである。次に、2つの複合体の相互作用面を比較して、Ivy-lysozyme相互作用の強固さをもたらす鍵となる残基を特定した。 どちらのIvy-HEWL複合体でも、Ivy-HEWL相互作用には、塩橋、側鎖が関与する水素結合、側鎖/主鎖、主鎖の相互作用が同程度含まれている。 しかし、リゾチームとの相互作用に関与する数多くの残基のうち、厳密に保存されているのは3つだけである。 すなわち、HEWL活性サイト内で直接水素結合（E35-OE1）と水分子を介した間接水素結合（D52-OD1）の両方を形成しているヒスチジン残基（IvycではH60、Ivyp1ではH62）、アスパラギン酸残基（IvycではD61、Ivyp1ではD63）、グルタミン酸残基（IvycではE120、Ivyp1ではE123）である。 次に、2つの複合体の相互作用領域を比較した。 Ivyc分子は二量体であるため、Ivyc-HEWL複合体形成時に埋没する表面積は、Ivyp-HEWL複合体の場合（≒1,000Å2）よりも大きい（≒1,340Å2）。 この違いが、Ivyp1の阻害活性がIvycに比べて低い（25倍）ことを説明していると考えられる。