本研究は、K. R. Porterが愛した膜システム、すなわち筋繊維の小胞体（SR）に基づいています。 ポーターは、すべての筋細胞の筋原線維を完全に取り囲む豊富な膜システムを、その位置（小胞体）と広範なネットワーク（小網）としての全体的な構造から、適切にSRと命名した。 ポーターは、H.S.ベネットと共同で始めたSRの記述（1-3）において、この膜システムの2つの重要な側面を認識していた。 1つ目は、SRはすべての細胞種に共通する小胞体（ER）を単に特殊化したものであるということ、2つ目は、筋原線維に対するSRの正確な配置は、収縮性の制御の何らかの側面におけるSRの役割を示しているということである。 ポーターの洞察は、いずれも現在では完全に裏付けられている。 筋細胞が分化すると、SRに特異的なタンパク質が非常に豊富になることが知られている（4, 5）。 筋細胞から最初に精製された3つのタンパク質は、弛緩時にカルシウムを筋細胞内腔に送り込むカルシウムATPaseまたはカルシウムポンプタンパク質（6）、筋細胞内腔のカルシウム容量を大幅に増加させる低親和性カルシウム結合タンパク質であるカルセクトリン（7）、および筋の活性化時にカルシウム放出を行うリアノジン受容体（RyR）である（総説は文献8参照）。 後に、すべての種類の細胞には、カルシウムの処理を担うこれら3つのタンパク質の細胞特異的な形態および／または類似体が存在することが判明した。 すべての細胞において、これらのタンパク質はまとめて存在する傾向がある。 SRは、筋肉細胞のERの広範で特殊な領域である。 逆に、すべての細胞にはSRのような特殊なドメインがあるが、その量ははるかに少ない。 小脳のプルキンエ細胞のような筋肉を持たない細胞の中には、筋肉に特異的なRyRとカルセクストリンのアイソフォームを含む広範なSR様ドメインを持つものがあります(9, 10)。
Porterが独特のスタイルで書いているように、具体的には、”筋原線維に対する小胞体の正確な形態的関係….、このシステムが筋収縮において機能的に重要であることを示唆しています。” 。 筋収縮の制御におけるSRの特異的な役割についての理解は、PorterがSRについて記述した前後のエキサイティングな時期に発表された重要な論文によって形成された。 50年代後半から60年代前半にかけて行われたA. F. Huxleyの局所刺激実験は、電気的事象を筋線維内部に広げることができる特定の経路の存在を示し、表面の脱分極と中心部に位置する筋線維の急速な活性化との間に重要な関係をもたらした（レビューは文献11を参照）。 1959年に発表されたA.ウェーバーの重要な論文は、今では一般的な細胞内メッセンジャーとして認識されているカルシウムイオンが、筋収縮の制御に関与していることを初めて証明した(12)。 江橋氏とA.Weber氏は、SRのカルシウム封鎖能力が弛緩を完全に説明するという明確な証拠を構築し、W.Hasselbach氏はSRのカルシウムポンプ作用を正確に定義し、大陸を越えて互いに影響を与え合いました（レビューは文献13を参照）。
Porter の研究室で L. D. Peachey に密着していた私は、A. F. Huxely の結果から始まった、筋繊維のプラズマ層とその内部の間に、電気的事象を繊維内部に迅速に広げることができるようなリンクを探していることを十分に理解していました (14)。 1957年に発表された論文(3)で、PorterとPaladeは、筋原線維のバンドに正確に関連して配置されている反復構造単位であるトライアドを記述した。 トライアドは、2つのSRシスターナが中央の細管に近接して配置されている。 三極管（3）とその中心となる管（15-17）の位置は、局所的な脱分極によって生じる収縮の内側への広がりが起こる場所と一致する（11）。 Andersson-Cedergren (18) は、丹念な連続切片を用いて、三極管の中心要素が筋線維を横切って連続的なネットワークを形成していることを証明したので、三極管のこれらの構成要素を横（T）管と呼んでいる。 そのため、電子顕微鏡学者の目はT字管に向けられ、私はポーターの研究室でのポスドク研修期間の終わり頃（1963年）に迎えた発見の準備をしていました。 ポーターの水槽で飼育されていたグッピーの骨格筋の薄切片を見ていたら、突然、繊維の端にT字管の口が大きく開いている例を繰り返し目にしたのです。 ポーターの注意を引くのは簡単だった。 ポーターの研究室に入ったのは午後10時から11時の間で、彼がリラックスできる時間帯だった。 ポーターはすぐに興味を示した。 私の写真は彼の高い水準には達していなかったので、彼は私のブロックの1つを手に取り、自ら薄切片を作成し、芸術作品のような一連の顕微鏡写真を撮影しました（Fig.1A）。 ポーターの顕微鏡写真は、最終的に出版された論文の図版のほとんどを構成しており、T字管が表面の膜の脱分極を繊維内部に広げる役割を果たすために必要な本質的特徴を備えていることを示しています（19、図1Bも参照）。 T字管の内腔が細胞外空間と連続していることは、同年、細胞外空間トレーサー（20、21）や蛍光色素（22）を浸透させることでも確認された。 T字管が表面の膜と連続していることが、筋繊維の大きな表面膜容量の基礎となっている。
SRの機能ドメインは、表面の膜またはT字管と結合しており（図1C、G）、カルシウム放出ユニットと呼ばれる明確な結合部を形成している（レビューは23、24参照）。 興奮-収縮（e-c）結合時には、外部の膜が最初に脱分極され、その直後にSRは筋原線維の空間にカルシウムを放出する。 構造的な問題としては、これらの特殊な接合部位におけるSRと外部膜の間の関係はどのようなものかということであり、これによって電気的事象を筋の活性化中のSRからのカルシウムの放出に変換することができる。 25年ほど時間をさかのぼって、電子-交流結合のこのステップに関する現代の構造的な疑問は、カルシウム放出ユニットにおけるSRと外部膜のタンパク質の空間的な関係は何か、そしてこの関係から何が推測できるか、ということである。 リアノジン受容体（RyR）、すなわちSRカルシウム放出チャネル（8）、カルセクトリン（7、25）、トリアジン（26）、およびジャンクチン（27）である。 RyRは、大きな細胞質ドメインと合計質量約2,000kDaの4つの同一サブユニットからなるホモ4量体カルシウムチャネルであり、このチャネルが開くと、SRカルシウムが筋原線維の空間に速やかに放出される。 電子顕微鏡で見ると、RyRの細胞質ドメインは、接合部であるSRの表面と外部膜をつなぐ足のように見える（図1C、D）。 このように、RyRは表面の膜と相互作用するために戦略的に配置されている。 カルセクストリンは、SRのシステルナの内腔タンパク質であり、SRのジャンクションドメインの近くに位置している（図1B、C）。 その機能は、比較的高い遊離カルシウム濃度を維持しながら、SR内腔のカルシウムに対する総容量を増加させることであり、その結果、SR内腔と筋原線維との間のイオン性カルシウム濃度の大きな勾配を可能にしている。 トリアジンはおそらくカルセクストリンをSRの表面に結合させ、RyRの近くに維持するタンパク質であり、ジャンクチンも同様の役割を担っていると思われる。 後者2つのタンパク質のいずれか、あるいはまだ同定されていない他のタンパク質が、カルセクトリンをカルシウム放出チャネルの近くに固定しておく役割を果たしている。 カルシウム放出ユニットに参加している外膜のジャンクションドメインには、1つの表面膜タンパク質が存在する(23)。それは、ジヒドロピリジン受容体(DHPR)とも呼ばれるL型カルシウムチャネルである。 DHPRは、カルシウムチャネルだけでなく、電圧センサーとしても機能し、その作用は、SRからのカルシウム放出を開始するのに必要である(28, 29)。
骨格筋では、DHPRは4つのグループに分かれていて、小さな正方形の角に位置している（図1E, I）。 DHPRの4つのグループは、4つのグループを構成する4つのDHPRのそれぞれが、その下にある足のサブユニットにリンクしているように見えるように、SRの足の順に並んだ配列を形成している（30, 31）。 このように、2つの主要なカルシウム放出ユニットタンパク質が構造的に直接関係していることは、e-cカップリングのいわゆる「機械的」仮説を裏付けるものである。この仮説は、T字管膜の電圧センサー（後にDHPRであることが示される）が脱分極を感知し、直接の分子的相互作用によってSRからのカルシウム放出に影響を与えるというものである（32）。 DHPRとRyRの関係について、構造的に不可解な点は、4つの足が交互に関連付けられており（図1のM）、DHPRとは直接つながっていない孤児の足（またはRyR）が残っていることである。 in vivoおよびin vitroでの様々な筋肉の比較研究から、骨格筋では交互配置がルールであり、それは2種類のRyRアイソフォームの存在には依存しないことが示されています。
最近、DHPR-RyR関係の分子的・発生的基盤の研究は、私の研究室の2人のポスドク（竹倉弘明博士とフェリシアーノ・プロタシ博士）の研究であり、P. D. Allen博士、K. G. Beam博士、B. E. Flucher博士、竹島弘明博士との共同研究でもあります。 私たちが最初に考えたのは、接合部の発生過程において、四分子の交互配置がどのように生み出されるかということです。 この疑問は、BC3H1細胞株の骨格筋由来の細胞を用いて、B.E.Flucher博士と共同で探究した。BC3H1細胞株は、細胞周辺部にDHPR、トリアジン、RyRの共局在するクラスターを形成する（33）。 これらの細胞の薄切片や凍結融解では、足と四つ葉の広範な秩序配列を含む、よく分化したカルシウム放出ユニットが見られる。 四分子は別の配置になっている。 接合部の多くは、要素が欠落した四分子を有しており、これらは培養の初期および後期に見られることから、多くは形成過程にある接合部を表していると考えられる。 興味深いことに、かなり不完全な状態であっても、四分子の配列は足の配列に対して交互に配置されており、この関係は2つのタンパク質間の相互作用に固有のものであることを示しています。
2つ目の疑問は、DHPRが4つ子にグループ化するのは骨格筋に特有のものなのか、それともe-c結合の基礎が異なると思われる筋肉にも存在するのかということです。 心筋には骨格筋とは異なるRyRとDHPRのアイソフォームが存在し、e-cカップリングにはDHPRを介したカルシウムの透過が必須であると思われる点で機能的に異なっている（34、35）。 心筋のDHPRとRyRは、骨格筋と同様に、光学顕微鏡レベルで共局在する部位に位置しており（図1F）、この共局在は、e-c結合装置の分化の初期に達成される（36-38）。 しかし、凍結融解してみると、心筋におけるDHPRの配置は骨格筋のそれとは異なることがわかる（図1I、Kを比較）。 DHPRは足の近くにありますが、足とは直接つながっていないようなので（図1N）、その相互作用は伝達物質（例えばカルシウム）を介した間接的なものかもしれません。
上記の情報は、e-c結合の研究のための2つのマウスモデルを理解することに直接関連しています。 1つのモデルでは、骨格のDHPRのメイン（α1）サブユニットが欠損しています。 このモデルでは、e-couplingの欠如により筋肉が収縮せず、発育が悪くなっています（これがdysgenicという用語の由来です）。 しかし、足の配列を含むトライアッドが形成されていることから、SR-表面結合の形成にRyRの存在は必要ないことがわかる。 DH-PRのクラスター（免疫標識で検出）やDHPRのテトラッド（凍結破壊で検出）は、遺伝子異常の筋細胞では欠落しているが、遺伝子異常の筋管を培養してDHPRのcDNAをトランスフェクションすると回復することから、テトラッドがDHPRから構成されていることが証明された（31, 39, 40）。 もう一つのモデルは、骨格型のRyRにターゲットを絞ってヌル変異を加えたもので、これもe-c結合のブロックをもたらす。 RyRを持たない筋線維は、予想に反して3つ組を形成する（41）（図1H）。 この3つ組には足がないので、dyspedicと呼ばれているが、それ以外は薄い切片では正常に見える。 dyspedic変異体から生まれた細胞株（1B5）もe-c結合を欠いている。 この細胞を用いて、私たちは、足がないにもかかわらず、dyspedicのSR-表面結合が形成され、トリアジンとDH-PRを含むことを示した(42)。 しかし、凍結融解では、dyspedic接合部に位置するDHPRのクラスターは4つに集合しない（図1L）。 骨格筋タイプ1のRyRをコードするcDNAを1B5細胞に発現させると、周辺にRyRスポットが形成され（図1P）、DHPRが4つにまとまって集合する（図1Q）。 したがって、DHPRがSR表面の接合部位に集まるためにはRyRの存在を必要としないが、4本鎖を形成するためには骨格のRyRとの相互作用が必要であることがわかった。 このことからも、骨格筋線維にRyRとDHPRの関連性が存在することが間接的に確認できる。 逆に、心筋に四分子が存在しないことは、RyR-DHPRのリンクが存在しないか、骨格筋のリンクとは異なることを示している。 心筋におけるRyR-DHPRリンクの存在と、その不在または相違は、e-couplingの機能的な意味を持つ。 K. R. Porterは、SRに関する我々の理解におけるこれらの進展を、正確に定義できる構造と機能の関係に基づいていることから、承認したことでしょう。