DNAクローニングは、生殖を目的として細胞が自発的に行うことができます。 これは無性生殖の一形態で、生物が断片に分裂し、その断片がそれぞれ元の生物のクローンである成熟した完全な個体に成長するというものです（「生殖断片化」参照）。DNAクローニングは、実験室の研究者が意図的に行うこともできます。 DNAクローニングを完成させるためには、特定の遺伝子を構成する生物のDNAの個別の小さな領域を得る必要があります。 しかし、ベクターでクローニングできるのは、比較的小さなDNA分子だけです。 そのため、生物のゲノムを構成する長いDNA分子を切断して、ベクターDNAに挿入できるような断片にする必要がある。 このような組換えDNA分子の製造を容易にするのが、2つの酵素です。 制限酵素制限酵素は、バクテリアが産生するエンドヌクレアーゼで、通常、小さな塩基対の配列（制限部位と呼ばれる）を認識し、この部位でDNAの両鎖を切断します。 制限部位は典型的な回文配列で、これは制限部位の配列が5’から3’の方向に読むとDNAの各鎖で同じであることを意味します。 このためには、切断される可能性のある各部位やその近くで宿主のDNAを修飾する必要がある。 修飾酵素は1つまたは2つの塩基にメチル基を付加し、このメチル基の存在が制限エンドヌクレアーゼによるDNAの切断を防ぐのです。
多くの制限酵素は、その認識部位で2本のDNA鎖に千鳥状の切り口を作ります。 これにより、スティッキーエンドと呼ばれる両端に張り出した一本鎖の「尾」を持つ断片が生成されます。 制限酵素は、認識部位で2本のDNA鎖を直線的に切断することもでき、その場合はブラントエンドが生成されます。 2. DNAリガーゼ通常のDNA複製において、DNAリガーゼは、岡崎断片と呼ばれる短いDNAの断片を端から端まで結合（ライゲーション）させる。 DNAクローニングでは、精製したDNAリガーゼを用いて、相補的な末端を持つ制限断片とベクターDNAの末端を共有結合させる。 DNAリガーゼは、相補的なスティッキーエンドとブラントエンドをライゲーションすることができるが、ブラントエンドのライゲーションは効率が悪く、スティッキーエンドのライゲーションに比べてDNAとDNAリガーゼの両方を高濃度に必要とする。 このため、DNAクローニングに使用される制限酵素の多くは、DNA鎖に千鳥状の切り込みを入れてスティッキーエンドを作ります。
DNA断片をクローニングするには、宿主細胞内で複製可能なベクターDNA分子に結びつけることが重要です。 ベクターと挿入されたDNA断片からなる1つの組換えDNA分子を宿主細胞に導入すると、挿入されたDNAはベクターとともに複製され、同一のDNA分子が大量に生成される。
ベクター＋DNA断片↓ 組換えDNA↓ 宿主細胞内での組換えDNAの複製↓ 精製されたDNA断片の分離、配列決定、操作
このスキームには数多くの実験的なバリエーションがありますが、実験室でのDNAクローニングにはこれらのステップが不可欠です
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