Klonowanie DNA może być wykonywane spontanicznie przez komórkę w celach reprodukcyjnych. Jest to forma rozmnażania bezpłciowego, w której organizm dzieli się na fragmenty, a następnie każdy z tych fragmentów rozwija się w dojrzałe, w pełni rozwinięte osobniki, które są klonami oryginalnego organizmu (Patrz fragmentacja reprodukcyjna).Klonowanie DNA może być również wykonywane celowo przez badaczy laboratoryjnych. W tym przypadku fragmentacja DNA jest techniką genetyki molekularnej, która pozwala badaczom na wykorzystanie technologii rekombinowanego DNA do przygotowania dużej liczby identycznych cząsteczek DNA.Aby klonowanie DNA mogło zostać ukończone, konieczne jest uzyskanie dyskretnych, małych regionów DNA organizmu, które stanowią określone geny. Tylko stosunkowo małe cząsteczki DNA mogą być klonowane w każdym dostępnym wektorze. Dlatego długie cząsteczki DNA, które składają się na genom organizmu, muszą zostać rozszczepione na fragmenty, które można wprowadzić do DNA wektora. Dwa enzymy ułatwiają produkcję takich rekombinowanych cząsteczek DNA:
1. Enzymy restrykcyjneEkzymy restrykcyjne są endonukleazami produkowanymi przez bakterie, które zazwyczaj rozpoznają małe sekwencje par zasad (zwane miejscami restrykcyjnymi), a następnie rozszczepiają obie nici DNA w tym miejscu. Miejsce restrykcyjne jest zwykle sekwencją palindromiczną, co oznacza, że sekwencja miejsca restrykcyjnego jest taka sama na każdej nici DNA, gdy jest odczytywana w kierunku od 5′ do 3′.Dla każdego enzymu restrykcyjnego bakterie wytwarzają również enzym modyfikujący, tak aby własne DNA bakterii gospodarza było chronione przed rozszczepieniem. Odbywa się to poprzez modyfikację DNA gospodarza w każdym potencjalnym miejscu rozszczepienia lub w jego pobliżu. Enzym modyfikujący dodaje grupę metylową do jednej lub dwóch zasad, a obecność tej grupy metylowej zapobiega cięciu DNA przez endonukleazę restrykcyjną.
Wiele enzymów restrykcyjnych wykonuje rozłożone w czasie cięcia w dwóch niciach DNA w miejscu ich rozpoznania, co generuje fragmenty z jednoniciowym „ogonem”, który zachodzi na oba końce, zwane lepkim końcem. Enzymy restrykcyjne mogą również wykonywać proste cięcia w dwóch niciach DNA w miejscu ich rozpoznania, co generuje tępe końce. 2. Ligaza DNAPodczas normalnej replikacji DNA, ligazy DNA katalizują łączenie koniec do końca (ligację) krótkich fragmentów DNA, zwanych fragmentami Okazaki. Do celów klonowania DNA, oczyszczona ligazy DNA jest używana do kowalencyjnego łączenia końców fragmentu restrykcyjnego i wektorowego DNA, które mają komplementarne końce. Są one kowalencyjnie ligowane razem poprzez standardowe wiązania fosfodiestrowe 3′ do 5′ DNA.Ligaza DNA może ligować komplementarne lepkie i tępe końce, ale ligacja tępych końców jest niewydajna i wymaga wyższego stężenia zarówno DNA jak i ligazy DNA niż ligacja lepkich końców. Z tego powodu, większość enzymów restrykcyjnych używanych w klonowaniu DNA wykonuje rozłożone w czasie cięcia w nici DNA, aby utworzyć lepkie końce.
Kluczem do sklonowania fragmentu DNA jest połączenie go z cząsteczką wektorowego DNA, która może replikować się w komórce gospodarza. Po wprowadzeniu pojedynczej rekombinowanej cząsteczki DNA (składającej się z wektora i wprowadzonego fragmentu DNA) do komórki gospodarza, wprowadzony fragment DNA może być replikowany wraz z wektorem, generując dużą liczbę identycznych cząsteczek DNA.Podstawowy schemat działania można podsumować następująco:
Wektor + fragment DNA↓ Rekombinowane DNA↓ Replikacja rekombinowanego DNA w komórce gospodarza↓ Izolacja, sekwencjonowanie i manipulacja oczyszczonym fragmentem DNA
Są liczne eksperymentalne wariacje tego schematu, ale te kroki są niezbędne do klonowania DNA w laboratorium.