Krzywe kalibracyjne są wykorzystywane do zrozumienia odpowiedzi przyrządu na analit oraz do przewidywania stężenia analitu w próbce.
Krzywą kalibracyjną tworzy się, przygotowując najpierw zestaw roztworów standardowych o znanym stężeniu analitu. Odpowiedź urządzenia jest mierzona dla każdego z nich i wykreślana w zależności od stężenia roztworu wzorcowego. Liniowa część tego wykresu może być następnie wykorzystana do przewidywania stężenia próbki analitu, poprzez skorelowanie jej odpowiedzi ze stężeniem.
Niniejszy film przedstawi krzywe kalibracyjne i ich zastosowanie, demonstrując przygotowanie zestawu wzorców, a następnie analizę próbki o nieznanym stężeniu.
Zestaw roztworów wzorcowych jest wykorzystywany do przygotowania krzywej kalibracyjnej. Roztwory te składają się z szeregu stężeń, które obejmują przybliżone stężenie analitu.
Roztwory standardowe są często przygotowywane za pomocą seryjnego rozcieńczania. Rozcieńczenie seryjne wykonuje się, przygotowując najpierw roztwór podstawowy analitu. Roztwór podstawowy jest następnie rozcieńczany o znaną ilość, często o jeden rząd wielkości. Nowy roztwór jest następnie rozcieńczany w ten sam sposób i tak dalej. W ten sposób uzyskuje się zestaw roztworów o stężeniach w zakresie kilku rzędów wielkości.
Krzywa kalibracyjna jest wykresem sygnału instrumentu w zależności od stężenia. Wykres wzorców powinien być liniowy i można go dopasować za pomocą równania y=mx+b. Nieliniowe części wykresu powinny zostać odrzucone, ponieważ te zakresy stężeń są poza granicą liniowości.
Równanie najlepiej dopasowanej linii może być następnie użyte do określenia stężenia próbki, wykorzystując sygnał urządzenia do korelacji ze stężeniem. Próbki z pomiarów, które leżą poza zakresem liniowym działki muszą być rozcieńczone, aby być w zakresie liniowym.
Granica wykrywalności urządzenia, lub najniższy pomiar, który może być statystycznie ustalona w szum, może być obliczona z krzywej kalibracyjnej, jak również. Ślepa próbka jest mierzona wielokrotnie. Granica wykrywalności jest ogólnie zdefiniowana jako średni sygnał ślepej próby plus 3-krotność jej odchylenia standardowego.
Na koniec, granica kwantyfikacji może być również obliczona. Granica oznaczalności to najniższa ilość analitu, która może być dokładnie oznaczona ilościowo. Oblicza się ją jako 10 odchyleń standardowych powyżej sygnału ślepej próby.
Jak już poznaliście podstawy krzywej kalibracyjnej, zobaczmy jak przygotować i wykorzystać ją w laboratorium.
Po pierwsze, przygotujcie stężony roztwór podstawowy wzorca. Dokładnie zważ wzorzec i przenieś go do kolby pomiarowej. Dodać niewielką ilość rozpuszczalnika i wymieszać tak, aby próbka się rozpuściła. Następnie uzupełnić rozpuszczalnikiem do kreski. Ważne jest, aby użyć tego samego rozpuszczalnika, co próbka.
Aby przygotować wzorce, odpipetować wymaganą ilość do kolby pomiarowej. Następnie wypełnić kolbę do kreski rozpuszczalnikiem i wymieszać.
Kontynuować wykonywanie wzorców przez pipetowanie z roztworu podstawowego i rozcieńczanie. Aby uzyskać dobrą krzywą kalibracyjną, potrzeba co najmniej 5 stężeń.
Następnie należy przeprowadzić badanie próbek za pomocą urządzenia analitycznego, w tym przypadku spektrofotometru UV-Vis, w celu określenia odpowiedzi instrumentu potrzebnej do uzyskania krzywej kalibracyjnej.
Przeprowadź pomiar pierwszego wzorca. Wykonaj pomiar pierwszego wzorca w przypadkowej kolejności, na wypadek gdyby wystąpiły jakieś błędy systematyczne. Zmierzyć każdy wzorzec 3-5x, aby uzyskać szacunkową wartość szumu.
Pomierzyć pozostałe wzorce, powtarzając pomiary dla każdego z nich. Zanotować wszystkie dane.
Na koniec przeprowadzić badanie próbki. Użyj tej samej matrycy próbki i warunków pomiaru, które zostały użyte dla wzorców. Upewnij się, że próbka mieści się w zakresie wzorców i w limicie urządzenia.
Aby skonstruować krzywą kalibracyjną, użyj programu komputerowego do wykreślenia danych jako sygnał vs. stężenie. Użyj odchylenia standardowego z powtórzonych pomiarów dla każdego punktu danych, aby utworzyć paski błędów.
Usuń części krzywej, które są nieliniowe, a następnie wykonaj regresję liniową i określ najlepiej dopasowaną linię. Wyjściem powinno być równanie w postaci y = m x + b. Wartość R2 bliska 1 oznacza dobre dopasowanie.
To jest krzywa kalibracji dla niebieskiego barwnika #1, mierzona przy 631 nm. Odpowiedź jest liniowa w zakresie od 0 do 15 mM.
Oblicz stężenie próbki, używając równania najlepiej dopasowanej linii. Absorbancja dla próbki wynosiła 0,141 i odpowiadała stężeniu 6,02 mM.
Jak już zobaczyliście jak krzywa kalibracyjna może być używana ze spektrofotometrem UV-Vis, spójrzmy na kilka innych użytecznych zastosowań.
Krzywe kalibracyjne są często używane w zastosowaniach elektrochemicznych, ponieważ sygnał elektrody musi być skalibrowany do stężenia jonów w roztworze. W tym przykładzie, dane zostały zebrane dla elektrody jonoselektywnej dla fluorków.
Dane dotyczące stężenia muszą być wykreślone na skali logarytmicznej, aby uzyskać linię. Ta krzywa kalibracyjna może być użyta do pomiaru stężenia fluorków w roztworze, takim jak pasta do zębów lub woda pitna.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa, lub HPLC, jest techniką rozdzielania i analizy, która jest często stosowana w chemii analitycznej. HPLC oddziela składniki mieszaniny na podstawie czasu potrzebnego cząsteczkom na przebycie drogi przez kolumnę chromatograficzną. Czas ten różni się w zależności od szeregu właściwości chemicznych cząsteczek.
Elucja cząsteczek jest mierzona za pomocą detektora, czego wynikiem jest chromatogram. Obszar piku może być skorelowany ze stężeniem przy użyciu prostej krzywej kalibracyjnej szeregu roztworów wzorcowych, jak w tym przykładzie popularnych składników sody.
W niektórych przypadkach, gdy matryca roztworu zakłóca pomiar rozpuszczalnika, klasyczna krzywa kalibracyjna może być niedokładna. W takich przypadkach przygotowuje się zmodyfikowaną krzywą kalibracyjną. W tym celu do próbki dodawany jest roztwór wzorcowy o różnej objętości. Tworzony jest wykres zależności sygnału od stężenia, gdzie punkt przecięcia x jest równy oryginalnemu stężeniu roztworu próbki. Więcej szczegółów na temat tej techniki można znaleźć w filmie naukowym JoVE „Metoda dodawania wzorca”.
Obejrzeliście właśnie wprowadzenie JoVE do krzywej kalibracyjnej. Teraz powinieneś już rozumieć, gdzie stosuje się krzywą kalibracyjną, jak się ją tworzy i jak można ją wykorzystać do obliczenia stężenia próbki.
Jak zawsze, dzięki za oglądanie!
Dziękuję za oglądanie!