Mikroskop konfokalny jest jednym z typów mikroskopu fluorescencyjnego 3D, w którym rozdzielczość jest zwiększona poprzez odrzucenie światła nieostrego. Odbywa się to za pomocą otworków o określonym promieniu otworka i sprawia, że jest on mikroskopem 3D: ze względu na ogniskującą naturę mikroskopu konfokalnego, jest on specjalnie odpowiedni do uzyskiwania obrazów 3D jako zbioru natężeń w różnych punktach przestrzeni.
Obrazy konfokalne bardzo dobrze nadają się do dekonwolucji Huygensa, z Opcją Optyczną Konfokalną Huygensa, z dwóch głównych powodów:
1. W mikroskopach konfokalnych współczynnik Nyquista jest o połowę niższy niż w mikroskopach szerokopolowych.
Jak działa mikroskop konfokalny
Systemy biologiczne są zazwyczaj strukturami trójwymiarowymi. Kiedy próbka znakowana fluoroforami jest zalewana wzbudzającym światłem lasera, tak jak w konwencjonalnej mikroskopii szerokopolowej, wynikowy obraz jest zwykle silnie zaburzony przez nieostre światło fluorescencyjne. Prowadzi to do rozmycia obrazu i powoduje znaczny spadek kontrastu. Mikroskopia konfokalna jest techniką redukującą to niechciane nieostre światło. W tej technice, światło wzbudzające jest ściśle ogniskowane w próbce. Światło emisyjne z ogniska jest zbierane przez ten sam obiektyw, po czym jest ogniskowane przez mały otwór i kierowane do fotodetektora (Rysunek 1 (a)). Nieostre światło emisyjne jest w znacznym stopniu blokowane przez otwór (Rysunek 1 (b)). W wyniku tej metody do detektora dociera tylko światło z ogniska. Wadą tej metody jest to, że blokowane jest również światło z innych miejsc w płaszczyźnie ogniskowej: mikroskopia konfokalna to punktowe wzbudzanie i punktowa detekcja. Jednym z rozwiązań jest rastrowe skanowanie próbki punkt po punkcie w celu zrekonstruowania pełnego obrazu, w którym zbierany jest tylko sygnał fluorescencyjny z płaszczyzny ogniskowej. Takie skanowanie rastrowe może być powtarzane dla różnych płaszczyzn ogniskowych, aby przekroić grube próbki i zrekonstruować trójwymiarowy obraz próbki.
Alternatywnie, możliwe jest również równoległe skanowanie próbki z wieloma punktami wzbudzenia, jak w przypadku mikroskopu Spinning Disk.
STED jest praktycznie rozszerzeniem punktowej mikroskopii konfokalnej. Wiązka STED musi być zogniskowana w próbce, aby uzyskać wysoką intensywność potrzebną do emisji stymulowanej, podczas gdy detekcja punktowa redukuje światło nieostre. Aby STED działał, centrum ogniska wzbudzenia i zero intensywności STED w ognisku w kształcie pączka muszą się idealnie pokrywać. Obraz może być uzyskany przez skanowanie rastrowe próbki, na przykład przy użyciu piezoelektrycznego stopnia skanującego. Rozmiar użytego otworka będzie określał głębię ostrości mikroskopu.
Dekonwolucja obrazów konfokalnych
Zastosowanie dekonwolucji na obrazach konfokalnych zwiększa ich rozdzielczość w x, y i z oraz uwalnia od szumu. Dzięki temu obrazy będą łatwiejsze do wizualizacji i analizy. Domyślnym algorytmem dla Confocal jest Classic Maximum Likelihood Estimation (CMLE), a domyślna wartość SNR wynosi 20. Sugerujemy, aby zacząć od domyślnych parametrów i zbadać inne wartości SNR, na przykład w celu optymalizacji wyników dekonwolucji. Nie należy myśleć o SNR jako o parametrze opisującym oryginalny obraz, ale jako o parametrze regulowanym, który kontroluje wynik dekonwolucji. Użycie zbyt dużej wartości SNR może być ryzykowne przy odtwarzaniu zaszumionych oryginałów, ponieważ może to spowodować wzmocnienie szumu. Zakłócony obraz konfokalny może mieć wartości SNR niższe niż 20. Inną opcją jest przetestowanie algorytmu GMLE (Maximum Likelihood Estimation) w celu poprawienia wyników. GMLE jest odpowiedni dla zaszumionych obrazów, takich jak konfokalne lub STED.
Testuj Huygensa za darmo na swoich obrazach konfokalnych
Zapraszamy do pobrania Huygensa przez naszą stronę Download i poproszenia o licencję testową z pełnymi opcjami.
Remko R.M. Dijkstra, Design and realization of a CW-STED super-resolution microscope setup, Master Thesis , University of Twente, 2012