Abstrakt
Wielu pacjentów doświadcza doskonałego fizycznego powrotu do zdrowia po operacji, jednak niektórzy z nich cierpią z powodu wahań nastroju, a nawet depresji. Depresja pooperacyjna może wynikać z zaburzeń funkcji poznawczych, bólu i osłabienia układu odpornościowego podczas operacji. Istnieje jednak większe prawdopodobieństwo, że za rozwój depresji może być odpowiedzialne znieczulenie ogólne. Zastosowaliśmy tutaj jeden z najczęściej stosowanych środków znieczulających, propofol, w modelu mysim, aby zbadać, czy ten dożylny związek znieczulający może wywoływać u myszy zachowania podobne do depresyjnych. Stwierdziliśmy, że pojedyncza dawka propofolu spowodowała znaczące zaburzenia behawioralne w testach zawieszenia ogona, wymuszonego pływania i otwartego pola. Zbadaliśmy również sekcje mózgowe tych myszy i wykazaliśmy, że ekspresja białka CD11b była znacznie zmniejszona, co świadczyło o hamującym wpływie propofolu na funkcję mikrogleju. Zbadaliśmy wpływ propofolu na białko synaptyczne, SYP, i stwierdziliśmy brak istotnego wpływu na ekspresję tego białka. Powyższe wyniki sugerują, że leczenie propofolem może promować zachowania podobne do depresji u myszy poprzez wpływ na funkcję komórek mikrogleju. Ponadto stwierdziliśmy, że poziom cytokiny IL-6 był znacząco podwyższony w tkance mózgowej, co mogło spowodować aktywację czynnika transkrypcyjnego STAT3. Nasze odkrycie może zapewnić nową perspektywę dla dalszego zrozumienia mechanizmu działania leków anestetycznych i rozszyfrowania mechanizmu leżącego u podstaw depresji pooperacyjnej.
1. Wprowadzenie
Wielu pacjentów poddawanych znieczuleniu ogólnemu lub zabiegowi chirurgicznemu doświadcza pewnej formy depresji pooperacyjnej, zwłaszcza w okresie sześciu miesięcy po inwazyjnym zabiegu. Jako jedno z częstych powikłań po operacji, depresja może prowadzić do dalszej zachorowalności i śmiertelności, zwłaszcza u pacjentów w podeszłym wieku. Tymczasem naukowcy odkryli, że pacjenci z depresją są bardziej narażone na inne powikłania po operacji . Są one mniej zdolne do współpracy dobrze z opiekunami w ich opieki pooperacyjnej, takich jak terapia rehabilitacyjna. U pacjentów, którzy mają już wcześniej istniejącą historię depresji lub lęku , czas powrotu do zdrowia z depresji pooperacyjnej jest znacznie dłuższy . Badanie sugeruje również, że operacja może nasilić nasilenie wcześniej istniejącej depresji . Do tej pory niewiele wiadomo o tym, dlaczego istnieje tak silny związek między chirurgii i depresji . Niektórzy badacze uważają, że psychologicznym powodem per se jest to, że wiele osób doświadcza depresji pooperacyjnej , ponieważ procedury chirurgiczne zmuszają ich do konfrontacji z własną śmiertelnością . W niektórych badaniach podkreślano również wpływ specyficznego rodzaju operacji per se na indukcję depresji pooperacyjnej, ponieważ depresja wydaje się być częściej obserwowana w przypadku niektórych poważnych operacji, w tym operacji mózgu, wymiany stawu biodrowego i resekcji nowotworu. Jednak ostatnie badania sugerują, że długość czasu spędzonego w znieczuleniu wydaje się być związana z prawdopodobieństwem i ciężkością depresji. Propofol jest jednym z najczęściej stosowanych środków znieczulających w warunkach intensywnej terapii po zabiegach chirurgicznych. Stwierdzono, że leczenie propofolem jest istotnie związane z zaburzeniami funkcji poznawczych w okresie pooperacyjnym. Dotychczas nie badano, czy i jak propofol może wpływać na stan nastroju u pacjentów i zwierząt. W związku z tym zastosowaliśmy model mysi z pojedynczą dawką propofolu i testowaliśmy zachowania depresyjne w modelu mysim. Stwierdziliśmy, że myszy poddane działaniu pojedynczej dawki propofolu przejawiały zachowania lękowe w teście otwartego pola, wykazując krótszy czas przebywania w obszarze centralnym, oraz zachowania depresyjne w testach zawieszenia ogona i pływania wymuszonego, wykazując dłuższy czas bezruchu niż myszy kontrolne, którym nie podawano propofolu. Nasze wyniki wskazały, że propofol może być odpowiedzialny za wahania nastroju po operacji, a efekt ten może być związany z wpływem propofolu na komórki mikrogleju w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN).
2. Materiały i Metody
2.1. Zwierzęta i leczenie lekami
W obecnym badaniu użyto 8-10 tygodniowych samców myszy C57BL/6. Wszystkie myszy miały swobodny dostęp do wody i pożywienia. Dla wszystkich badań na zwierzętach tutaj, myszy były traktowane ściśle według wytycznych ustanowionych przez Chińską Radę Opieki nad Zwierzętami. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Animal Care Committee of Qingdao Municipal Hospital, Shandong, Chiny. W badaniu uczestniczyły dwie grupy myszy: normalna sól fizjologiczna (kontrola; ) i propofol (75 mg/kg; ). Pojedyncza dawka propofolu została podana myszom dootrzewnowo. Użyto komercyjnego roztworu do iniekcji propofolu (Xi’an Libang Pharmaceuticals, Chiny). Dawka propofolu zastosowana tutaj została zaadaptowana z poprzedniego badania . W czasie znieczulenia wszystkie myszy zostały umieszczone na podkładce grzewczej, aby utrzymać ich temperaturę ciała. Testy behawioralne przeprowadzono 1 tydzień później.
2.2. Otwarte pole
Do testu otwartego pola użyto kwadratowej drewnianej skrzynki, jak opisano wcześniej. Na początku testu każda mysz została umieszczona w rogu pudełka, twarzą do ściany. Całkowita przebyta odległość i całkowity czas spędzony w wewnętrznych kwadratach przez wszystkie myszy były rejestrowane i mierzone w 5-minutowej sesji.
2.3. Test podwieszania ogona
W przypadku testu podwieszania ogona, procedury przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami. Myszy zawieszono za ogony za pomocą taśmy na małym metalowym haku, w tej pozycji nie mogą uciec ani trzymać się pobliskich powierzchni. Zarejestrowano całkowity czas, jaki myszy spędziły w bezruchu podczas 6-minutowego okresu testowego. Bezruch jest definiowany jako brak prób poruszania ciałem przez myszy.
2.4. Test wymuszonego pływania
Test wymuszonego pływania przeprowadziliśmy zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami. Myszy umieszczono w szklanej zlewce wypełnionej wodą o temperaturze pokojowej. Badaliśmy całkowity czas unieruchomienia myszy w 15-minutowej sesji testowej, a ostatnie 6 minut było punktowane za czas trwania bezruchu. Po zakończeniu każdego testu, mokre myszy były natychmiast umieszczane w klatce z normalną ściółką, po uprzednim ogrzaniu ich w suchym ręczniku.
2.5. Elevated Plus Maze Test
Wyniesiony labirynt plus jest prostą metodą oceny reakcji lękowych u zwierząt. Zbadaliśmy poziom lęku u myszy przy użyciu testu podwyższonego labiryntu plus, jak wcześniej opisano. Zasadniczo, aparat elevated plus maze jest wyposażony w dwa otwarte i dwa zamknięte ramiona i podniesiony do wysokości około 50 cm nad ziemią. Na początku każdego testu mysz umieszczano w centralnym kwadracie, zwróconą w stronę otwartego ramienia, a następnie pozwalano jej na eksplorację ramion przez 5 minut. Ilość czasu spędzonego w otwartych ramionach była rejestrowana i analizowana przez osobę, która nie była zaangażowana w projektowanie eksperymentu.
2.6. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Pomiar poziomu IL-6 w tkankach mózgu wykonaliśmy przy użyciu komercyjnego zestawu ELISA (eBioscience, Thermo Fisher Scientific). Każda próbka była oznaczana w sposób duplikowany z odpowiednimi rozcieńczeniami, tak aby względne jednostki luminescencji mieściły się w zakresie liniowym krzywych standardowych. Wartość IL-6 z każdej próbki została znormalizowana i wyrażona jako stosunek w porównaniu do całkowitego białka ładunku jako stosunek względny. Absorbancja każdej próbki była mierzona za pomocą czytnika mikropłytek (Synergy Mx, BioTek, Winoski, VT).
2.7. Western Blot
Rozpuszczone próbki mózgu były przetwarzane i poddawane obróbce na żelach SDS-PAGE. Następnie przenoszono je na membrany PVDF, które blokowano 5% mlekiem odtłuszczonym w buforze TBST. Zablokowane membrany były dalej badane przeciwciałami do CD11b (1 : 4000; Abcam, UK), synaptofizyny (SYP), p-Stat-3 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA) i całkowitego Stat-3 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA) w mleku TBST przez noc w 4°C. Po inkubacji z przeciwciałami drugorzędowymi odpowiednio przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, pasma białek na membranie były ujawniane w reakcji chemiluminescencji. Jako kontrolę wewnętrzną stosowano β-aktynę (1 : 5000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Wyniki ilościowe wyrażono jako stosunek każdego białka docelowego do jego β-aktyny.
2.8. Analiza statystyczna
Wartości prezentowane w pracy zostały przedstawione jako the . Istotność różnicy pomiędzy dwiema grupami została określona za pomocą analizy testem Studenta. Wartość mniejsza niż 0,05 uznawana była za istotną statystycznie.
3. Wyniki
3.1. Single Dose of Propofol Exposure Caused Depressive-Like Behaviours in Mice with Tail Suspension and Forced Swimming Tests
Po pierwsze, sprawdziliśmy hipotezę, czy pojedyncza dawka propofolu może powodować długotrwały wpływ na zachowanie myszy poprzez skupienie się na sposobie depresji. Zastosowaliśmy zawieszenie ogona i testy wymuszonego pływania u tych myszy, aby zbadać długoterminowe skutki propofolu. W teście zawieszenia ogona stwierdziliśmy, że propofol znacznie wydłużył czas unieruchomienia w porównaniu z myszami kontrolnymi bez leczenia propofolem, gdy myszy były zawieszone na ogonach (Figura 1). Aby dodatkowo potwierdzić zachowania podobne do depresji u myszy narażonych na propofol, użyliśmy metody pływania siłowego do pomiaru czasu unieruchomienia tych myszy. Nasze wyniki wykazały, że propofol zwiększył całkowity czas unieruchomienia w porównaniu z myszami z grupy kontrolnej (rysunek 2). Powyższe ustalenia ujawniły, że pojedyncza dawka leczenia propofolem może powodować i podtrzymywać długotrwałe zachowanie depresyjne u myszy.
3.2. Single Dose of Propofol Exposure Caused Anxiety-Like Behaviours in Mice with Open Field and Elevated Plus Maze Tests
Lęk jest najczęstszym powikłaniem współwystępującym w depresji. Dlatego postulowaliśmy, czy propofol może wywoływać zachowania lękowe u tych myszy, opierając się na powyższych wynikach behawioralnych u tych myszy. Do badania poziomu lęku u tych myszy użyliśmy testu otwartego pola. Jak pokazano na Rysunku 3(a), leczenie propofolem skutecznie zmniejszyło całkowity czas spędzony przez myszy na obszarze centralnym w otwartym polu. Zmierzyliśmy również inny ważny parametr testu, całkowitą odległość przemieszczania się myszy. Zgodnie z naszymi oczekiwaniami, wstrzyknięcie propofolu znacząco zmniejszyło odległość przemieszczania się myszy w 5-minutowej sesji testowej w porównaniu z myszami kontrolnymi (rysunek 3(b)). Następnie zbadaliśmy zachowania lękowe tych myszy w teście podwyższonego labiryntu plus. Stwierdziliśmy, że myszy poddane działaniu propofolu wykazywały znacznie mniej czasu spędzonego w otwartych ramionach (Figura 4), co było zgodne z wynikami z testu otwartego pola.
(a)
(b)
(a)
(b)
3.3. Single Dose of Propofol Exposure Caused the Increased Level of IL-6 in the Brain Tissues of Mice
Ostatnie badanie sugerowało udział neuroinflammation w pooperacyjnych delirium-like cognitive deficits . Sprawdziliśmy, czy propofol może wpływać na poziom ekspresji IL-6 w tkankach mózgowych tych myszy. Aby osiągnąć ten wniosek, wykonaliśmy test ELISA w tkankach mózgowych (hipokamp i kora), aby ocenić poziom IL-6 u myszy z lub bez leczenia propofolem. Nasze wyniki wykazały, że leczenie propofolem w tych warunkach może być w stanie podnieść poziom ekspresji tej cytokiny w mózgach myszy narażonych na działanie propofolu (Figura 5). Wynik ten wskazywał, że propofol może wywoływać zachowania lękowo-depresyjne u myszy poprzez wpływ na odpowiedź zapalną w ich mózgach.
3.4. Single Dose of Propofol Exposure Caused the Reduced Expression of CD11b and Increased Expression of p-STAT-3 in the Brain Tissues of Mice
Ostatnio sondowaliśmy możliwe mechanizmy komórkowe i molekularne, które mogą być odpowiedzialne za zmiany behawioralne u tych myszy narażonych na propofol. Sprawdziliśmy, czy na komórki glejowe miało wpływ leczenie propofolem, badając białko markera mikrogleju, CD11b. Za pomocą badania western blot stwierdziliśmy, że poziom ekspresji CD11b był zmniejszony w mózgach myszy z leczeniem propofolem (Figura 6(a)), co sugerowało, że funkcja mikrogleju może być regulowana przez leczenie propofolem. Tymczasem ekspresja presynaptycznego białka SYP nie została zmieniona przez leczenie propofolem (Figura 6(c)). Zbadaliśmy również funkcję czynnika transkrypcyjnego STAT-3 poprzez zbadanie statusu fosforylacji STAT-3 (p-STAT-3). Nasze wyniki western blot wykazały, że leczenie propofolem spowodowało wzrost poziomu ekspresji p-STAT-3 bez wpływu na ekspresję całkowitego STAT-3 (Figura 6(b)). Wyniki te sugerują, że propofol może wpływać na funkcję komórek mikrogleju i zwiększać fosforylację STAT-3 podczas wywoływania zachowań lękowych i depresyjnych u myszy.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4. dyskusja
Dysfunkcje poznawcze i pamięciowe zostały dość dokładnie zbadane, ale pooperacyjne wahania nastroju nie przyciągały jak dotąd wystarczającej uwagi. Niektóre dowody wspierały ideę, że istnieją znaczące zmiany nastroju u pacjentów, którzy są narażeni na operację i leczenie anestezjologiczne. W niniejszej pracy testowaliśmy nową hipotezę, że samo leczenie anestezjologiczne może być wystarczające do istotnego wpływu na nastrój u zwierząt, które poddano pojedynczej dawce środka znieczulającego bez towarzyszącego zabiegu chirurgicznego. Jako reprezentatywny związek anestetyczny zastosowano propofol i wstrzyknięto go myszom dootrzewnowo. W kolejnych dniach przeprowadzono serię zachowań depresyjnych i lękowych w celu obserwacji zmian nastroju u myszy. Stwierdziliśmy, że istniały znaczące różnice w zachowaniach między tymi myszami z lub bez ekspozycji na propofol. Ponieważ te efekty wywołane propofolem utrzymywały się przez znaczny czas, nawet po odstawieniu leku, postulowaliśmy, że te efekty nie były ostrym wpływem anestetycznym, ale były mediowane przez inne systemy w OUN.
Neurozapalenie zostało uznane za jeden z głównych czynników, które przyczyniają się do depresji i innych zmian nastroju w OUN. Tutaj zapytaliśmy, czy komórka mikroglejowa została aktywowana w mózgu myszy po ekspozycji na propofol. Marker białkowy komórek mikrogleju, CD11b, który jest jednym ze wspólnych białek markerowych do wykazania aktywacji mikrogleju, został zbadany za pomocą western blot. Zaskakująco, nasze wyniki wskazały, że propofol może hamować poziom białka CD11b. Prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że propofol mógł hamować ekspresję białka CD11b niezależnie od tego, czy komórki mikrogleju były aktywowane czy nie. Wybitne zaawansowanie propofolu może być ważne dla potencjalnego leczenia łagodzącego nadaktywność mikrogleju w niektórych stanach patologicznych OUN, takich jak uraz, udar i stwardnienie rozsiane. Zbadaliśmy również wpływ propofolu na białka synaptyczne, które są bardzo ważnymi czynnikami warunkującymi zachowanie zwierząt. Co ciekawe, chociaż propofol mógł wpływać na funkcję komórek mikrogleju, nie miał wpływu na poziom ekspresji białek synaptycznych. Wyniki te nie są zgodne z niektórymi wcześniejszymi doniesieniami. Możliwy powód może być spowodowany różnicą okna czasowego, kiedy białka zostały zebrane po podaniu propofolu. Ale nasze wyniki nadal sugerują, że propofol może mieć inny wpływ na neuron i inne komórki glejowe. W przyszłych badaniach, wpływ propofolu na komórki glejowe i neuronalne powinien być opracowany indywidualnie.
Odpowiedź neurozapalna w OUN narażonym na pojedynczą dawkę propofolu była dalej potwierdzana testem ELISA IL-6 w tych dwóch grupach myszy. Stwierdziliśmy, że leczenie propofolem może wywołać wzrost IL-6 w mózgu myszy. Odkrycia te były zgodne z wynikami propofolu na funkcji komórek mikrogleju. Hamując składnik CD11b, propofol może aktywować odpowiednie szlaki sygnałowe, które są ważne dla aktywacji komórek mikrogleju.
Całościowo, nasze badanie sugeruje, że propofol był w stanie wpłynąć na funkcję komórek mikrogleju i zaostrzyć odpowiedź zapalną w OUN. Reakcja komórkowa i molekularna może być odpowiedzialna za zmiany behawioralne u tych myszy, którym podano pojedynczą dawkę propofolu. Nasze badania podkreślają istotną rolę środków znieczulających na wpływ zmian nastroju po operacji, ale na nastrój może mieć istotny wpływ wiele czynników, w tym stan zapalny, który jest dość często obserwowany u pacjentów w trakcie i po operacji. Dlatego też w przyszłości warto przeprowadzić serię dobrze zaprojektowanych, systemowych badań na modelu zwierzęcym, które obejmowałyby nie tylko środki znieczulające, ale również procedurę chirurgiczną.
Dostępność danych
Dane wykorzystane do poparcia wyników tego badania są dostępne na życzenie u autora odpowiadającego za badanie.
Konflikt interesów
Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Departamentu Ortopedii, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao, Shandong, Chiny, oraz wsparcie techniczne ze strony Weifang Medical University, Weifang, Chiny.