Wszystkie pasy: przeciwciało beta Actin – kontrola obciążenia (ab8227) w rozcieńczeniu 1/5000
Pas 1: HeLa whole cell extract
Pas 2: Ekstrakt komórek drożdży
Pan 3: Mouse brain tissue lysate
- Zobacz naszą listę dostępnych pozytywnych kontroli lizatów, peptydów blokujących i białek kontroli pozytywnej.
- Zobacz przeciwciała drugorzędowe AbExcel dla wyjątkowych Western Blot.
- Zobacz nasze łatwe do wykonania protokoły wideo.
Protokoły są dostarczane przez Abcam „AS-IS” w oparciu o eksperymenty w laboratoriach Abcam z użyciem odczynników i produktów Abcam; Twoje wyniki z użyciem protokołów poza tymi warunkami mogą się różnić.
Transkrypt z seminarium
Celem western blottingu jest rozdzielenie białek na żelu w zależności od ich masy cząsteczkowej. Białka są następnie przenoszone na membranę, gdzie mogą być wykryte przy użyciu przeciwciał. Podgrzewaj próbki do 95 stopni C przez pięć do 10 minut w buforze do próbek zawierającym środek redukujący, taki jak beta-merkaptoetanol. Powoduje to linearyzację białek z ładunkiem ujemnym proporcjonalnym do ich wielkości.
Włóż żel do zbiornika do elektroforezy i dodaj bufor, upewniając się, że górne części studzienek są przykryte. Procent akrylamidu w używanym żelu zależy od masy cząsteczkowej docelowego białka. Nanieść rynek masy cząsteczkowej na pierwszy pas, a następnie załadować próbki do sąsiednich studzienek. Wszystkie próbki, które zawierały równe ilości białka. Gdy wszystkie próbki zostaną załadowane, dodać bufor, umieścić pokrywę na zbiorniku do elektroforezy. Włączyć zasilanie i ustawić napięcie zalecane przez producenta żeli w zbiorniku żelowym. Powinno być widać pęcherzyki powietrza unoszące się w zbiorniku. Prowadzić żel do momentu, aż czoło matrycy przesunie się wystarczająco w dół żelu.
Kolejnym etapem jest przeniesienie białek z żelu na membranę. Membrany są zwykle wykonane z nitrocelulozy lub PVDF. Wyjąć żel z pojemnika i ostrożnie wyjąć go z plastikowej obudowy. Rozciąć studzienki i stopę żelu i umieścić żel w buforze transferowym. Przygotować stos transferowy, umieszczając membranę i żel pomiędzy bibułą filtracyjną i gąbkami. Membrana powinna być przyłożona do elektrody dodatniej, a żel najbliżej elektrody ujemnej. Użyj małego wałka, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza między żelem a membraną. Zamknąć komorę transferową i zanurzyć ją w zbiorniku transferowym zawierającym bufor transferowy. Dodaj wody do komory zewnętrznej, aby utrzymać system w chłodzie i załóż pokrywę. Włącz zasilanie, aby rozpocząć transfer białek. Czas i napięcie wymagają optymalizacji, więc sprawdź instrukcje producenta w celu uzyskania wskazówek.
Teraz, gdy białka migrują z żelu na membranę nitrocelulozową, interesujące białko może być wykryte jako przeciwciało. Membrana może zostać usunięta z kasety, a masa cząsteczkowa powinna być teraz widoczna. Jeśli jest to wymagane, transfer białek może być potwierdzony przez wybarwienie membrany roztworem. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał, membrana musi zostać zablokowana. Wlać bufor blokujący na membranę i delikatnie mieszać na kołyszącym się urządzeniu. Zazwyczaj robi się to przy użyciu roztworu pięcioprocentowego mleka lub surowiczej albuminy bydlęcej (BSA) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni. Czas i rodzaj buforu blokującego powinien być zoptymalizowany, więc sprawdź arkusz danych przeciwciała pierwotnego, którego zamierzasz użyć, aby uzyskać szczegółowe informacje.
Po zablokowaniu membrany usuń bufor blokujący i dodaj rozcieńczone przeciwciało pierwotne w tym samym roztworze. Inkubować na wahadłowcu jak poprzednio. Zazwyczaj inkubacja przeciwciał pierwszorzędowych trwa jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub całą noc w temperaturze 4 stopni C. Stężenie przeciwciał i czas inkubacji należy zoptymalizować. Wskazówki można znaleźć w arkuszu danych przeciwciała. Zlać przeciwciało pierwszorzędowe i dwukrotnie przepłukać membranę w buforze do płukania. Następnie wykonać jedno 15-minutowe płukanie i trzy 10-minutowe płukania na kołyszarce. Bufor płuczący to zwykle Trys buffered saline, TBS, lub phosphate buffered, saline, PBS, z 0,1 procent tween 20.
Odlać bufor płuczący i inkubować membranę w koniugującym przeciwciało drugorzędowe, które zostało rozcieńczone w buforze blokującym. Zwykle robi się to przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, ale stężenie przeciwciał i czas inkubacji będą musiały być zoptymalizowane. Oderwać przeciwciało drugorzędowe i przemyć membranę, jak pokazano wcześniej.
Istnieje kilka różnych systemów do wykrywania. Jeśli przeciwciała drugorzędowe sprzęgają się z enzymem, przed obrazowaniem należy inkubować membranę w odpowiednim substracie. Jeśli przeciwciała drugorzędowe są fluorescencyjnymi koniugatami, można przejść bezpośrednio do etapu obrazowania. Obrazowanie może być wykonane przy użyciu kliszy rentgenowskiej lub systemu obrazowania cyfrowego. Umieścić membranę na tacce do obrazowania. Umieścić tacę do obrazowania w systemie obrazowania. Czasy ekspozycji będą najprawdopodobniej musiały być zoptymalizowane w celu wyraźnego wykrycia pasm związanych z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.