Heading

Abstract

Wprowadzenie. Układ Purkinjego i fałszywe ścięgna (FTs) są związane z arytmią komorową, ale związek pomiędzy włóknami Purkinjego i FTs nie jest jasny. W niniejszej pracy badano związki cech anatomicznych i elektrofizjologicznych pomiędzy włóknami Purkinjego i FTs. Metody i wyniki. Zoptymalizowaliśmy protokół barwienia włókien Purkinjego roztworem jodyny Lugola w celu zbadania struktury anatomicznej i opracowaliśmy nową metodę mapowania elektrofizjologicznego, nazwaną metodą bezpośredniego mapowania wizualnego (DVM), w celu zbadania cech elektrofizjologicznych. Stosując wyżej wymienione innowacje u 12 psów, stwierdziliśmy, co następuje. (1) Nie stwierdzono obecności włókien Purkinjego 0,5 cm-1,0 cm poniżej pierścienia zastawki, na płatkach lub strunach ścięgnistych zastawki mitralnej lub w sąsiedztwie górnej 1/3 części mięśnia brodawkowatego. (2) Włókna Purkinjego występowały we wszystkich FT, także w mniejszych i drobnych FT. (3) Włókna Purkinjego zawarte w FT rozciągały się od końca proksymalnego do dystalnego, a ich charakterystyka elektrofizjologiczna była podobna do włókien znajdujących się we wsierdziu, włączając w to przewodzenie anterogradalne, retrogradalne i dekrementalne oraz automatyzm. Wnioski. Włókna Purkinjego są powszechnie obecne w FT. Charakterystyka elektrofizjologiczna włókien Purkinjego znajdujących się w FT jest podobna do włókien znajdujących się we wsierdziu. FT mogą mieć anatomiczne i elektrofizjologiczne podłoże dla arytmii komorowej.

1. Wstęp

Sieć Purkinjego jest wyspecjalizowanym układem przewodzącym w sercu odpowiedzialnym za przewodzenie elektryczne w komorach, a także jest zaangażowana w mechanizm niektórych tachyarytmii komorowych (nazwanych arytmiami związanymi z Purkinjego), w tym monomorficznego częstoskurczu komorowego (VT), polimorficznego VT i migotania komór (VF). Fałszywe ścięgno (FT) jest częstą wewnątrzkomorową zmianą anatomiczną. Odnosi się do włóknistej lub włóknisto-mięśniowej struktury, która istnieje w komorze obok normalnego połączenia mięśnia brodawkowatego i zastawki mitralnej lub trójdzielnej. Wiele badań klinicznych wykazało, że FT są ściśle związane z arytmiami komorowymi. Idiopatyczny częstoskurcz komorowy (Idiopathic left ventricular tachycardia – ILVT) jest częstą komorową arytmią reentryczną wywodzącą się z lewej komory. Stwierdzono, że jego podłoże anatomiczne jest ściśle związane z FT. FT są również związane z występowaniem przedwczesnych pobudzeń komorowych. Czy FTs ma anatomiczne i elektrofizjologiczne podłoże dla arytmii komorowej? W niektórych wcześniejszych badaniach stwierdzono obecność komórek Purkinjego w FTs. Czy jednak istnienie włókien Purkinjego w FT jest przypadkiem, czy też zjawiskiem powszechnym? Czy te włókna Purkinjego mają właściwości przewodzenia elektrycznego i jaką rolę odgrywają w arytmiach komorowych, nie zostało dobrze zbadane.

2. Materiały i Metody

2.1. Izolacja i przygotowanie serca

Wszystkie protokoły eksperymentów na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Szpitala Ogólnego Dowództwa Teatru Północnego. Wszystkie procedury w eksperymentach na zwierzętach były w pełni zgodne z zaleceniami dotyczącymi badań na zwierzętach według Deklaracji Helsińskiej Światowego Stowarzyszenia Medycznego oraz europejskich (2010/63/UE) wytycznych dotyczących opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

W badaniach wykorzystano 12 psów rasy kundel (21,5 ± 2,5 kg). Psy te zostały znieczulone midazolamem (0,5 mg/kg IM), a następnie uśmiercone poprzez wstrzyknięcie powietrza (100-150 ml) do żyły udowej. Serca pobierano bezpośrednio po śmierci przez sternotomię pośrodkową. W zależności od różnych celów eksperymentalnych, serca były przygotowywane i przetwarzane tak szybko, jak to było możliwe. Wsierdzie sześciu serc zabarwiono roztworem Lugola w celu obserwacji struktury anatomicznej włókien Purkinjego. Kolejne sześć serc wykorzystano do obserwacji charakterystyki elektrofizjologicznej układu Purkinjego metodą mapowania wizualnego. Metoda przygotowania serca do barwienia roztworem Lugola i mapowania wizualnego była następująca. Najpierw serce in vitro nacinano od pierścienia zastawki mitralnej do koniuszka wzdłuż lewej wolnej ściany komory, a następnie nacinano pierścień aortalny, aby w pełni odsłonić przednie i tylne mięśnie brodawkowate lewej komory. Następnie, wsierdzie zostało stosunkowo spłaszczone, a resztki krwi na wsierdziu zostały usunięte za pomocą wacika.

2.2. Barwienie roztworem Lugola

Roztwór Lugola został przygotowany z wyprzedzeniem (krótszym niż tydzień) przez rozpuszczenie I2 (4%, ) i KI (4%, ) w dejonizowanej wodzie w łagodnych warunkach i był chroniony przed światłem. Roztwór Lugola rozpylano równomiernie na wsierdzie przygotowanego serca i pozostawiano do nasiąknięcia na 0,5-2 minuty w celu wybarwienia włókien Purkinjego. Proces barwienia powtarzano, jeśli kolor wyblakł lub zniknął. Mikroskop stereoskopowy (obiektyw anatomiczny) był używany do uwidocznienia małych lub złożonych struktur anatomicznych.

2.3. Barwienie histologiczne

Serca utrwalono w 10% formalinie, zatopiono w parafinie i pocięto na plastry o grubości 5 μm. Wycinki tkanki barwiono hematoksyliną-eozyną (HE), barwnikiem Massona, barwnikiem okresowym Schiffa (PAS) i immunohistochemicznie connexinem 40.

2.4. Metoda bezpośredniego mapowania wizualnego

Preparowane serce zanurzono w ogrzanym (37°C) mlecznym roztworze Ringera. Dwa 20-elektrodowe cewniki o dużej gęstości (1 mm elektrody; 1 mm odstępu) umieszczano blisko regionu zainteresowania w bezpośrednim polu widzenia, takiego jak gałąź włókien Purkinjego, przednie lub tylne mięśnie brodawkowate oraz FT. Następnie przeprowadzono badania elektrofizjologiczne i mapowanie, w tym programowaną stymulację, mapowanie aktywacji i mapowanie tempa, w warunkach in vitro. Serce było zanurzane w zimnym (<10°C) mlecznym roztworze Ringera na 5 sekund, jeśli utrzymująca się arytmia (taka jak VT lub VF) nie była możliwa do przerwania przez tempo lub jeśli konieczne było zatrzymanie automatycznej aktywności elektrycznej. Ta metoda mapowania wsierdzia jest określana jako metoda DVM (direct visual mapping).

3. Wyniki

3.1. Charakterystyka anatomiczna włókien Purkinjego

Lewy układ Hisa-Purkinjego wywodził się spod granicy zatoki wieńcowej i prawej zatoki wieńcowej. Dawał on początek lewej i prawej odnodze pęczka Hisa. Nie stwierdzono obecności gałęzi włókien Purkinjego 0,5 cm-1,0 cm poniżej pierścienia zastawki, w tym zastawki aortalnej i mitralnej, z wyjątkiem lewej odnogi pęczka Hisa między zatoką wieńcową a prawą zatoką wieńcową. Na płatkach i strunach ścięgnistych zastawki mitralnej nie stwierdzono obecności gałęzi włókien Purkinjego. Główne gałęzie lewej gałęzi przedniej i tylnej rozchodziły się do FT, które łączyły się z bocznymi ścianami mięśni brodawkowatych. Nie stwierdzono natomiast gałęzi włókien Purkinjego przylegających do górnej 1/3 części mięśnia brodawkowatego (ryc. 1).

(a)

(b)

(c)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Rycina 1

Rozmieszczenie włókien Purkinjego we wsierdziu lewej komory. (a, d) nie stwierdzono obecności gałęzi włókien Purkinjego w obrębie 0,5 cm poniżej zastawki mitralnej; (b, e) wykazano brak gałęzi włókien Purkinjego w obrębie 0,8 cm poniżej zastawki aortalnej; (c, f) nie stwierdzono obecności gałęzi włókien Purkinjego na koniuszku mięśni brodawkowatych. MVL, płatek zastawki mitralnej; LCC, lewy koniuszek wieńcowy; RCC, prawy koniuszek wieńcowy.

3.2. Charakterystyka anatomiczna FT

FT występowały na wsierdziu u wszystkich 12 psów, a ich długość była zróżnicowana. W sumie 19 FT było dłuższych niż 1 cm (średnio 2,4 ± 1,03 cm; od jednego do trzech FT u każdego z 12 psów). Ponadto istniało 66 mniejszych FT o długości od 0,5 do 1 cm (od 2 do 8 FT u każdego z 12 psów), przy czym małe FT (poniżej 0,5 cm) występowały częściej u każdego psa. Spośród 19 dłuższych FT, pięć łączyło się z mięśniami brodawkowatymi przednimi, 12 z mięśniami brodawkowatymi tylnymi, a pozostałe dwa nie łączyły się z żadnym mięśniem brodawkowatym. Wszystkie FT zawierają włókna Purkinjego, w tym mniejsze i drobne FT. Włókna Purkinjego zawarte w FT rozciągają się od końca proksymalnego do dystalnego i łączyły się z włóknami Purkinjego wsierdzia z mięśniami brodawkowatymi lub sąsiednimi włóknami Purkinjego wsierdzia (ryc. 2). Co ciekawe, w większych FT istniało typowe, pracujące miokardium i vasa vasorum (ryc. 3). Przeciwnie, nie było włókien Purkinjego ani miokardium w strunach ścięgnistych, które łączyły mięśnie brodawkowate z płatkiem zastawki mitralnej (rycina 2).

(a)

(b)

(c)

(d)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

Rycina 2

Charakterystyka rozmieszczenia włókien Purkinjego na strunach ścięgnistych (true tendons) i FT. (a) Barwienie płynem Lugola we wsierdziu psa: Włókna Purkinjego zabarwione na ciemno. (b, c i d) Brak włókien Purkinjego w strunach ścięgnistych, które łączyły się z zastawką mitralną. (b) Powiększony trójkątny obszar z (a). (c) Barwienie Massona strun ścięgnistych (×100). d) Barwienie immunohistochemiczne koneksyny 40 na strunach ścięgnistych (×100). (e, f, g, i h) Wszystkie FT zawierają włókna Purkinjego. (e) Powiększony obszar gwiazdy z (a) (×5). (f) Powiększony obszar prostokątny w (e) (g) Barwienie FT metodą Massona (×100). (h) Barwienie immunohistochemiczne koneksyny 40 w FTs (×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.3. Electrophysiological Characteristics of Purkinje Fibers on the FTs

Przy użyciu metody DVM, aktywność elektryczną włókien Purkinjego rejestrowano na wsierdziu komór zebranych serc poprzez stymulację lewej komory lub rejestrację automatycznej aktywności elektrycznej. Aktywację elektryczną zebranego serca można było zarejestrować w czasie 38 min∼80 min (56,5 ± 15,1 min).

Charakterystyka elektrofizjologiczna włókien Purkinjego na FT była podobna do włókien na wsierdziu, włączając w to dwukierunkowe przewodzenie i automatyzm (ryc. 4). Stwierdzono również obniżenie przewodnictwa we włóknach Purkinjego na FT (ryc. 4), szczególnie podczas urazu mechanicznego przez lekką trakcję. W obszarze nakładania się FTs rejestrowano wiele rzędów potencjałów Purkinjego (Rycina 5).

Rycina 4

Elektrofizjologiczne mapowanie wsierdzia metodą DVM. (a) Dwa 20-elektrodowe cewniki mapujące umieszczono na wsierdziu przegrody LV od przegrody górnej do koniuszka. Jeden cewnik mapujący (P1-P20) umieszczono na jednym z FT, a drugi (P21-P40) na sąsiedniej sieci Purkinjego. Punkt stymulacji znajduje się na proksymalnym końcu FT (czerwona gwiazda). (b) Barwienie płynem Lugola we wsierdziu psa: Włókna Purkinjego zabarwiono na ciemniejszy kolor. (c) Podczas stymulacji z proksymalnych FT, przy długości cyklu 400 ms, kierunek przewodzenia włókien Purkinjego znajdujących się w FT był od końca proksymalnego do dystalnego, a kierunek przewodzenia włókien Purkinjego na koniuszku wsierdzia był od końca dystalnego do proksymalnego. Po zaprzestaniu stymulacji obserwowano automatyzm włókien Purkinjego z FT (od 4 do 8 pobudzeń). (d) Przy stymulacji o długości cyklu 250 ms wystąpiło przewodzenie dekrementalne włókien Purkinjego, a sekwencje aktywacji włókien Purkinjego były takie same jak przy stymulacji 400 ms (c).

(a)

(b)

(a)
(b)

Rycina 5

Wielokrotne potencjały rejestrowano w zachodzącym na siebie obszarze FTs. (a) 20-elektrodowy cewnik do mapowania umieszczono w obszarze nakładania się FTs; (b) zarejestrowano wiele rzędów potencjałów Purkinjego.

4. Dyskusja

4.1. Major Findings

Włókna Purkinjego są szeroko rozmieszczone w FT, które łączyły wsierdziowe włókna Purkinjego z włóknami Purkinjego mięśni brodawkowatych lub przyległego wsierdzia. Charakterystyka elektrofizjologiczna włókien Purkinjego znajdujących się w FT była podobna do włókien Purkinjego znajdujących się na wsierdziu.

4.2. The Anatomical Distribution of the Purkinje System in the Left Ventricular Endocardium

Rozmieszczenie włókien Purkinjego w wsierdziu ma pewne cechy charakterystyczne. W tym badaniu, mimo że włókna Purkinjego są szeroko rozmieszczone we wsierdziu, nie ma gałęzi włókien Purkinjego pod zastawką mitralną i górną 1/3 mięśnia brodawkowatego. W drodze odpływu lewej komory pod zastawką aortalną nie ma gałęzi włókien Purkinjego z wyjątkiem lewej odnogi pęczka Hisa między zatoką niewieńcową a prawą zatoką wieńcową (ryc. 1). Cechy te są bardzo ważne dla analizy mechanizmów arytmii komorowych. Na przykład podczas mapowania przedwczesnych zespołów komorowych (PVCs) pochodzących z obszaru RCC często rejestruje się potencjały wysokiej częstotliwości w sąsiedztwie RCC, przed załamkami QRS PVCs. Potencjały te nie powinny być traktowane jako potencjały włókien Purkinjego .

4.3. Anatomiczna i elektrofizjologiczna charakterystyka FT

FT są pojedynczymi lub licznymi, cienkimi, włóknistymi lub włóknisto-mięśniowymi strukturami, które przebiegają przez jamę lewej komory i nie mają połączenia z koniuszkami zastawek. FT są bardzo często spotykane we wsierdziu psów. Stwierdzono, że FT zawierają tkankę włóknistą, włókna mięśnia sercowego, włókna Purkinjego i naczynia krwionośne. Komórki Purkinjego nie były obserwowane w badanych próbkach .

Wykazaliśmy, że włókna Purkinjego były powszechnie obecne w FT, w tym w mniejszych i drobnych FT. Włókna Purkinjego zawarte w FT rozciągają się od końca proksymalnego do dystalnego (ryc. 2). Charakterystyka elektrofizjologiczna włókien Purkinjego zawartych w FT była podobna do włókien znajdujących się na wsierdziu, włączając w to przewodzenie dwukierunkowe, przewodzenie dekrementalne i automatyzm (ryc. 4 i 5). Poszczególne elementy FT nie są takie same: niektóre zawierają włókna kolagenowe i włókna Purkinjego, a niektóre także włókna mięśnia sercowego i naczynia odżywcze (ryc. 3).

Spekulujemy, że korelacja między FT a systemem włókien Purkinjego może stanowić anatomiczną i elektrofizjologiczną podstawę dla FT uczestniczących w arytmii komorowej. Kiedy system włókien Purkinjego (włączając FT) jest uszkodzony przez mechaniczną trakcję, niedokrwienie, niedotlenienie lub inne czynniki, jego charakterystyka elektrofizjologiczna może się odpowiednio zmienić, skutkując komorowymi arytmiami.

4.4. Implikacje kliniczne

Zgłaszana częstość występowania FT u pacjentów kierowanych na badanie echokardiograficzne była bardzo zróżnicowana i wynosiła od 0,8% do 61% u dzieci i od 0,3 do 71% u dorosłych. Niektóre badania wykazały, że FT mogą odgrywać ważną rolę w arytmiach komorowych, takich jak idiopatyczny częstoskurcz powięziowy lub częstoskurcz komorowy w strukturalnej chorobie serca, zwłaszcza u niektórych pacjentów z chorobą niedokrwienną serca. Suwa i wsp. stwierdzili, że ILVT nie był już wywoływany po chirurgicznej resekcji FTs. Jednak cechy anatomiczne i elektrofizjologiczne FT związane z arytmiami komorowymi nie zostały dobrze wyjaśnione.

Ponieważ korelacja między włóknami Purkinjego a FT może być związana z różnymi arytmiami komorowymi. Na przykład wykazano, że mechanizm leżący u podłoża częstoskurczu komorowego z lewej tylnej powięzi (LPF-VT) polega na reentry w układzie przewodzącym lewej komory. Jednak dokładny obwód reentry, a zwłaszcza substrat strefy wolnego przewodzenia, pozostaje niejasny. W kilku przypadkach LPF-VT zidentyfikowano FT łączący przegrodową część LPF z mięśniami brodawkowatymi jako część obwodu reentrantowego. Jednak w większości przypadków LPF-VT nie udawało się wykryć znaczących FT. W prezentowanym badaniu stwierdzono drobne FT łączące sąsiadującą sieć Purkinjego na wsierdziu. Spekulowaliśmy, że maleńkie FT mogą odgrywać ważną rolę w obwodzie reentrantowym LPF-VT. Ostry zakręt lub anizotropowe przewodzenie między FT a przyległą siecią Purkinjego może być podłożem strefy wolnego przewodzenia (ryc. 6).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

4.5. Ograniczenia

W niniejszym badaniu wystąpiło kilka ograniczeń. Po pierwsze, było to badanie na zwierzętach in vitro, a właściwości elektrofizjologiczne mogą różnić się w pewnym stopniu od tych z in vivo lub w modelu perfuzyjnym serca Langendorffa. Po drugie, czas dostępny na wizualne mapowanie właściwości elektrofizjologicznych włókien Purkinjego był ograniczony. Po trzecie, charakterystyka mniejszych i drobnych FT i ich odpowiedź na werapamil lub katecholaminę nie zostały dobrze wyjaśnione w tym badaniu. Dalsze badania powinny być prowadzone nad histologiczną i elektrofizjologiczną charakterystyką mniejszych i drobnych FT.

5. Wnioski

Włókna Purkinjego są szeroko rozpowszechnione w FT kłów, w tym w mniejszych i drobnych FT. Włókna Purkinjego zawarte w FT rozciągają się od proksymalnego do dystalnego końca, anatomicznie i elektrofizjologicznie łącząc się z wsierdziowym systemem włókien Purkinjego, który może być ważnym substratem dla arytmii komorowych.

Dostępność danych

Dane statystyczne i obrazowe użyte do poparcia wyników tego badania są zawarte w artykule.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z publikacją tej pracy.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Hongyue Wang za pomoc techniczną przy barwieniu histologicznym oraz Dr. Shehata za recenzję językową. Praca ta była wspierana przez National Key Project of Research and Development (contract nos. 2016YFC0900900, 2017YFC1307800, and 2016YFC1301300).