Heading

Wyniki

Overall Structure of E. coli Ivy Protein .

Białko kodowane przez gen ykfE uległo ekspresji i oczyszczeniu w kontekście projektu genomiki strukturalnej, systematycznie ukierunkowanego na geny E. coli o nieznanej funkcji. Białko YkfE zostało przypadkowo odkryte, że kopiuje, a następnie krystalizuje się z HEWL używanym w rutynowym protokole rozbijania bakterii. Białko YkfE zostało następnie scharakteryzowane jako silny i specyficzny inhibitor lizozymu typu C (7), a nazwa genu została zmieniona na Ivy (inhibitor lizozymu kręgowców), aby odzwierciedlić tę właściwość. Struktury krystaliczne o wysokiej rozdzielczości zostały uzyskane dla bluszczu E. coli (Ivyc) zarówno w izolacji, jak i w kompleksie z lizozymem .

Opis struktury.

Wcześniej wykazaliśmy za pomocą filtracji żelowej i badań fluorescencyjnych, że peryplazmatyczny homodimer Ivyc jest fizjologicznie aktywną jednostką, z dimeryzacją K d w zakresie 10-9 M (7). Białko Ivyc krystalizuje się jako dimer. Krystaliczna jednostka asymetryczna zawiera trzy molekuły odpowiadające niekrystalograficznemu dimerowi i monomerowi. Stosując symetrię krystalograficzną, monomer ten rekonstruuje fizjologiczny dimer. Każdy monomer składa się z centralnego arkusza β zbudowanego z pięciu antyrównoległych pasm β, flankowanego po stronie wypukłej przez dwie krótkie helisy (α1, α2; odpowiednio 6 i 8 reszt), a po stronie wklęsłej przez helisę amfipatyczną (α4; 11 reszt) (ryc. 1). Strukturalnych homologów tej domeny poszukiwaliśmy za pomocą programu DALI (8). Najlepszym strukturalnym odpowiednikiem w PDB jest 306-aa acetylotransferaza histonu (kod PDB 1BOB) z drożdży (Z = 5.2), z tylko 9% identycznych reszt w 89 aminokwasach i rmsd 4.0 Å. Jednakże topologia obu struktur jest znacząco różna, co czyni strukturę Ivy nowym złożeniem. Struktura dimeru wykazuje fałd w kształcie podkowy skupiony na dwóch antyrównoległych amfipatycznych heliksach (α4) (Rys. 1 b). W krysztale znajduje się 1,605-Å2 powierzchni zakopanej pomiędzy dwoma monomerami związanymi krystalograficzną osią 2-krotności (monomer A) i 1,432-Å2 powierzchni zakopanej pomiędzy dwoma monomerami związanymi niekrystalograficzną osią 2-krotności (monomery B i C). Współczynnik rmsd pomiędzy trzema monomerami waha się od 0,547 Å (B/C) do 0,865 Å na 122 reszty (A/B) na podstawie superpozycji Cα. Struktura ujawnia, że w dimerze zachodzą oddziaływania pomiędzy szkieletami i łańcuchami bocznymi reszt skupionych w C-końcowej części cząsteczki w nici β6 oraz w helisach α4 i α5 (Rys. 2 b). Reszty te są konserwowane w różnych szczepach E. coli, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae i sekwencjach homologicznych Burkholderia cepacia, co sugeruje, że białko Bluszczu jest funkcjonalnym dimerem u tych bakterii i prawdopodobnie monomerem u innych bakterii zawierających Bluszcz.

Mechanizm inhibicji lizozymu: The Ivyc-HEWL Complex Structure (PDB Code 1GPQ).

Krystaliczna jednostka asymetryczna zawiera jeden niekrystaliczny homodimer Ivyc w kompleksie z dwiema cząsteczkami HEWL. Istniej± dwa rodzaje oddziaływań Ivyc/HEWL: główne oddziaływanie obejmuj±ce 969-Å2 powierzchni zakopanej pomiędzy jednym monomerem Ivyc i jedn± cz±steczk± HEWL oraz drugorzędowe oddziaływanie obejmuj±ce 552-Å2 powierzchni zakopanej pomiędzy drugim monomerem Ivyc i t± sam± cz±steczk± HEWL, tworz±c w ten sposób 1,340-Å2 powierzchni zakopanej pomiędzy homodimerem Ivyc i pierwsz± cz±steczk± HEWL (Rys. 2 a). Dla drugiego monomeru HEWL, powierzchnia zakopana wynosi 1,043 Å2 dla głównego oddziaływania i 623 Å2 dla oddziaływania wtórnego, co prowadzi do całkowitej powierzchni zakopanej 1,361-Å2 pomiędzy homodimerem Ivyc i drugą cząsteczką HEWL.

Struktura kompleksu potwierdza eksperymentalną stechiometrię oddziaływania pomiędzy Ivyc i HEWL (7) i natychmiast sugeruje mechanizm hamowania lizozymu przez cząsteczkę Ivyc. W wyniku utworzenia kompleksu Ivyc/HEWL miejsce aktywne lizozymu zostaje zablokowane przez pętlę wystaj±c± z cz±steczki Ivyc (Rys. 2 c i d). W centrum tej pętli, reszta histydynowa (H60) tworzy wiązania wodorowe z dwiema z trzech reszt odpowiedzialnych za aktywność enzymatyczną lizozymu (D52 i E35). Cząsteczka lizozymu skompleksowana z Ivyc nie wykazuje istotnych zmian strukturalnych (rmsd ≈0,5 Å na 127 reszt na podstawie superpozycji Cα 1HEL z cząsteczkami lizozymu w krysztale). Jednakże, jedna cząsteczka wody jest wyłączona z miejsca aktywnego lizozymu i zastąpiona histydyną z pętli hamującej Ivyc.

Porównanie wyrafinowanych struktur Ivyc w izolacji i w kompleksie z HEWL (Rys. 2 b i Tabela 2 SI) ujawnia kilka drobnych zmian konformacyjnych. Należą do nich orientacja małej helisy (α3) w trzech monomerach wolnej formy Ivyc. Orientacja obserwowana w cząsteczce A jest najbardziej zbliżona do tej obserwowanej w dimerze Ivyc skompleksowanym z HEWL. Trzy 310-heliksy (η1, η2 i η3) widoczne w strukturze Ivyc/HEWL s± nieobecne w trzech nieskompleksowanych cz±steczkach Bluszczu. Co bardziej zaskakuj±ce, wystaj±ca pętla Bluszczu bezpo¶rednio oddziałuj±ca z miejscem aktywnym lizozymu nie wykazuje zauważalnej zmiany konformacyjnej pomiędzy obiema formami krystalicznymi. Sztywność tej dość krótkiej pętli można wytłumaczyć obecnością wiązania disiarczkowego (C57-C62) i mostka solnego pomiędzy resztami lizyny (K58) obok pierwszej cysteiny i asparaginianu (D61) obok drugiej cysteiny. Te ograniczenia strukturalne sugerujące interakcję typu key-lock z lizozymami typu C mogą tłumaczyć ścisłe zachowanie sekwencji pętli pomiędzy podzbiorem homologów Ivy (ortologów Ivyc) nawet u bakterii odległych od siebie (Ryc. 3 i SI Ryc. 5).

Badania funkcjonalne: Characterization of ΔIvy E. coli Mutants.

Centralna rola pętli CKPHDC w inhibicji została eksperymentalnie potwierdzona przez mutagenezę ukierunkowaną. Substytucje aminokwasowe zostały przeprowadzone w celu oceny wpływu niektórych kluczowych reszt oddziałujących, jak sugeruje struktura kompleksu Ivyc/HEWL. Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano niższą aktywność inhibitorową dla mutantów histydynowych (H60). Najbardziej drastyczny efekt (300-krotny wzrost K i) zaobserwowano po wprowadzeniu ujemnie naładowanej reszty asparaginowej w tej pozycji (SI Tabela 3). Efekt ten jest najprawdopodobniej spowodowany odpychaj±cym oddziaływaniem z dwiema kwasowymi resztami miejsca aktywnego lizozymu (D52 i E35). Z drugiej strony, nie zaobserwowano znaczącej zmiany w aktywności inhibitorowej, gdy wprowadzono mutację C62 → A62 zaburzającą mostek disulfidowy.

Wykonaliśmy nokaut genu bluszczu E. coli, aby ocenić efekt ochronny in vivo białka bluszczu w obecności lizozymu. Wyłączny nokaut genu bluszczu w E. coli nie wykazywał fenotypu zwiększonej wrażliwości na HEWL, potwierdzając tym samym, że w warunkach laboratoryjnych lizozym nie penetruje ściany bakteryjnej (9). Następnie skonstruowaliśmy podwójnego mutanta poprzez wprowadzenie delecji TolB-pal, aby odtworzyć fenotyp „porowatej ściany komórkowej” opisany wcześniej (10). Wcześniej wykazano, że mutanty E. coli ΔtolB wykazują typowy fenotyp wrażliwości na leki i detergenty, nieszczelność i tworzenie pęcherzyków błony zewnętrznej (10, 11), z powodu upośledzonej syntezy otoczki. Zmierzyliśmy wrażliwość na lizozym podwójnego mutanta ΔtolBΔivy w odniesieniu do mutanta ΔtolB (JC864). W warunkach laboratoryjnych stwierdzono, że mutant ΔtolB jest wrażliwy na stężenie lizozymu wyższe niż to, które występuje w wydzielinach (>50 μg-ml-1; SI Fig. 6), wykazując w ten sposób, że cząsteczki wielkości białka, oprócz małych cząsteczek, mogą przenikać przez takie nieszczelne komórki E. coli. Następnie przebadano mutanta ΔtolBΔivy i stwierdzono, że wykazuje on większą wrażliwość na HEWL, ponieważ już dla stężeń fizjologicznych (50 μg-ml-1; ryc. 4 a) widoczny był efekt lizozymu na wzrost bakterii, co potwierdza ochronną rolę Ivyc. Ten ochronny efekt został dodatkowo potwierdzony po nadekspresji Ivyc w podwójnym mutancie ΔtolBΔivy niosącym plazmid ekspresyjny indukowany izopropylo β-d-tiogalaktozydem (Rys. 4 b), gdzie ekspresja Ivy była w stanie przywrócić wzrost bakterii dla stężeń lizozymu do 500 μg-ml-1. Podobne wyniki zostały również opisane w kontekście innych zabiegów permeabilizujących (9).

Rodzina białek Bluszczu: Phylogenetic Distribution.

Wyczerpujące wyszukiwanie homologów białka Ivy E. coli przeprowadzono przy użyciu wszystkich publicznie dostępnych danych sekwencyjnych, w tym kompletnych sekwencji genomu bakteryjnego i danych z trwających projektów sekwencjonowania ze wszystkich głównych ośrodków sekwencjonowania genomów (patrz Materiały i Metody). Wszystkie zidentyfikowane sekwencje homologiczne Ivy były iteracyjnie wykorzystywane jako zapytania w celu optymalizacji wykrywania bardziej odległych ewolucyjnie krewnych. Zidentyfikowano w sumie 35 różnych sekwencji podobnych do Ivy (od 100% do <25% identyczności sekwencji z białkiem Ivy E. coli K12). Co zaskakujące, homologi Ivy zidentyfikowano tylko u przedstawicieli Proteobacteria (bakterii Gram-ujemnych), a wszystkie z nich są przewidywane jako peryplazmatyczne (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). Z jednej strony może wydawać się logiczne, że białka Bluszczu kolokalizują się z cząsteczką proteoglikanu (substratem lizozymu) w przedziale peryplazmatycznym. Z drugiej strony, uważa się, że sieć proteoglikanów jest fizycznie osłonięta przez ścianę komórkową Proteobacteria przed atakiem egzogennych enzymów i nie jest uważana za naturalny substrat dla lizozymu. Obecność genu kodującego inhibitor lizozymu u bakterii Gram-ujemnych, a nie Gram-dodatnich jest więc paradoksem. Na ryc. 3 przedstawiono drzewo filogenetyczne homologów Ivy, zgodnie ze standardowym podziałem Proteobacteria (12): alfa, beta, gamma, delta i epsilon. Na dzień dzisiejszy rodzina białek Ivy jest najliczniej reprezentowana w pionach gamma i beta, ale dwa homologi Ivy zostały jednoznacznie zidentyfikowane u dwóch niespokrewnionych gatunków z pionu alfa: Parococcus denitrificans i Gluconobacter oxydans. W obrębie podziałów gamma i beta, homologi bluszczu są sporadycznie rozmieszczone. Na przykład, homologi bluszczu są obecne we wszystkich Enterobacteriales, z wyjątkiem Salmonella, ale występują również we wszystkich sekwencjonowanych Pseudomonadaceae. Podobnie w dziale beta, homologi bluszczu występują u wszystkich Burkholderia, są zidentyfikowane u jednego gatunku Neisseriaceae, a są nieobecne w wielu innych sekwencjonowanych genomach tego działu. Tak sporadyczne rozmieszczenie rodziny białek Ivy wskazuje na złożoną historię ewolucyjną, na którą składają się różne utraty genów w poszczególnych kladach, na które nakładają się zdarzenia horyzontalnego transferu, jak sugeruje szczegółowa analiza filogenetyczna (Ryc. 3). Z wyjątkiem alfaproteobakterii, większość gatunków posiadających ortologi Bluszczu jest patogenami lub patogenami oportunistycznymi dla człowieka lub innych kręgowców.

Ortologiczne vs. paralogiczne homologi Bluszczu.

Większość zidentyfikowanych członków rodziny białek Bluszczu, włączając najbliższe homologi Bluszczu E. coli, wykazuje absolutną konserwację podciągu CKPHDC (SI Rys. 5a ). Motyw ten dokładnie pokrywa się z pętlą hamującą lizozym zidentyfikowaną w strukturze 3D kompleksu HEWL/Ivyc oraz w naszych badaniach funkcjonalnych mutantów pętli Ivyc (patrz wyżej). W oparciu o te dane, sklasyfikowaliśmy homologi Ivy wykazujące tę sekwencję pętli jako bona fide ortologi genu bluszczu E. coli (tj. przewidywane jako inhibitory lizozymu i pełniące tę samą funkcję u odpowiednich gatunków). Dwie dodatkowe sekwencje ortologiczne zawierają niemal dokładne zachowanie pętli, przy czym reszta asparaginowa jest zastąpiona resztą asparaginową w sekwencji Burkordelia cepacia Ivy (48% identyczności z Ivyc), a reszta lizynowa jest zastąpiona resztą argininową w sekwencji Gluconobacter oxydans 621H Ivy (26% identyczności z Ivyc). Analiza tych mutacji w kontekście struktury 3D kompleksu Ivyc/HEWL sugeruje, że obie powinny być zgodne z prawidłową interakcją lizozym/Ivy, a tym samym z hamowaniem lizozymu. Pięć pozostałych homologów bluszczu, wykazujących niekanoniczne sekwencje pętli, określono następnie jako paralogi bluszczu E. coli (tj. przewidywane do pełnienia różnych funkcji) (SI Rys. 5b ). Paralogi Ivy występują tylko w obrębie gatunków z rodzaju Pseudomonas: P. aeruginosa, P. syringae, P. putida i P. fluorescens, wszystkie o pokrewnych, ale różnych sekwencjach pętli CExxDxC. Co więcej, P. aeruginosa jest jedynym gatunkiem wykazującym zarówno ortologiczną, jak i paralogiczną wersję Ivy. Sekwencja ortologiczna bluszczu P. aeruginosa jest również najbardziej podobna do sekwencji paralogicznej bluszczu P. aeruginosa, co silnie sugeruje, że duplikacja genu prowadząca do niekanonicznej pętli w paralogach bluszczu nastąpiła wzdłuż gałęzi prowadzącej do Pseudomonadaceae. Brak homologów bluszczu w bliskim rodzaju Acinetobacter może być spowodowany późniejszą utratą genów.

Ekspresja i funkcjonalna charakterystyka homologów bluszczu P. aeruginosa.

Aby sprawdzić nasze funkcjonalne przewidywania dotyczące ortologicznych i paralogicznych form bluszczu, poddaliśmy ekspresji (patrz Materiały i Metody) produkt obu genów związanych z bluszczem P. aeruginosa. Dwa białka nazwane Ivyp1 (ortolog) i Ivyp2 (paralog) zostały oczyszczone i przetestowane pod względem ich aktywności hamującej wobec HEWL. Zgodnie z przewidywaniami wynikaj±cymi z sekwencji pętli, białko Ivyp1 (CKPHDC) hamuje aktywno¶ć lizozymu, podczas gdy Ivyp2 (CEKSDC) nie. Wynik hamowania aktywności HEWL przez Ivyp1 przedstawiono na SI Rys. 7a . Podobnie jak w przypadku Ivyc, inhibicja następuje w mechanizmie „powolnego ścisłego wiązania” z Kiapp {Ivyp1, HEWL} wynoszącym ≈25 nM.

Struktura P. aeruginosa Ivyp1 (PDB Code 1UUZ).

Po wykazaniu, że P. aeruginosa Ivyp1 i E. coli Ivy wykazywały podobną aktywność antylizyozymową, określiliśmy strukturę kompleksu Ivyp1:HEWL, aby zobrazować, w jaki sposób interakcja hamująca została zachowana pomimo odległego podobieństwa sekwencji tych dwóch białek Ivy (30% identycznych reszt; SI Rys. 5a ). Zgodnie z oczekiwaniami, struktura Ivyp1 jest podobna do struktury monomeru Ivyc. Jednakże, zgodnie z przewidywaniami wynikającymi z niezachowania reszt zaangażowanych w tworzenie dimerów Ivyc, P. aeruginosa Ivyp1 jest monomerem.

Mimo tej znaczącej różnicy, oddziaływanie dwóch homologów Bluszczu z cząsteczką lizozymu jest nadzwyczaj podobne (Rys. 2, SI Rys. 7b , i SI Tabela 4). Cα rmsd pomiędzy monomerami Ivyp1 i Ivyc wynosi ≈2.8 Å. Następnie porównaliśmy powierzchnie oddziaływań w obu kompleksach, aby zidentyfikować kluczowe reszty odpowiedzialne za solidność interakcji Bluszcz-lizozym. W obu kompleksach Ivy, oddziaływanie bluszcz-liziezym obejmuje taką samą ilość mostków solnych, wiązań wodorowych z udziałem łańcuchów bocznych, łańcuchów bocznych/łańcuchów głównych oraz oddziaływań łańcuch główny-łańcuch główny. Jednakże, spośród licznych reszt zaangażowanych w interakcję z lizozymem, tylko trzy są ściśle konserwowane: reszta histydynowa (H60 w Ivyc, H62 w Ivyp1) tworząca zarówno bezpośrednie wiązanie wodorowe (E35-OE1), jak i pośrednie wiązanie wodorowe poprzez cząsteczkę wody (D52-OD1) w obrębie miejsca aktywnego HEWL, jedna reszta asparaginianowa (D61 w Ivyc i D63 w Ivyp1) oraz reszta glutaminianowa (E120 w Ivyc i E123 w Ivyp1). Następnie porównaliśmy obszary oddziaływań w obu kompleksach. Ze względu na dimeryczny stan cząsteczki Ivyc, powierzchnia zakopana podczas tworzenia kompleksu Ivyc-HEWL jest większa (≈1,340 Å2) niż w przypadku kompleksu Ivyp-HEWL (≈1,000 Å2). Różnica ta prawdopodobnie tłumaczy niższą aktywność inhibitorową (25-krotny spadek) Ivyp1 w porównaniu z Ivyc.