Ta praca opiera się na systemie błonowym, który był drogi K. R. Porterowi: siateczce sarkoplazmatycznej (SR) włókien mięśni prążkowanych. Porter odpowiednio ochrzcił obfity system błonowy, który ściśle i całkowicie otacza miofibryle we wszystkich komórkach mięśniowych jako SR, na podstawie jego lokalizacji (sarkoplazmatyczny) i ogólnej struktury jako rozległej sieci (retikulum). W swoich opisach SR, zapoczątkowanych we współpracy z H. S. Bennettem (1-3), Porter rozpoznał dwa ważne aspekty tego systemu błonowego. Pierwszym z nich jest to, że SR jest po prostu wyspecjalizowaną ekspresją retikulum endoplazmatycznego (ER), które przenika wszystkie typy komórek, a drugim to, że precyzyjne umiejscowienie SR w stosunku do miofibryli wskazuje na jego rolę w jakimś aspekcie kontroli kurczliwości. Oba spostrzeżenia Portera są obecnie w pełni potwierdzone. Wiadomo, że SR początkowo rozwija się jako ER zawierający typowe dla ogrodu różnorodne białka ER i że w miarę różnicowania się komórki mięśniowej staje się on znacznie wzbogacony w białka specyficzne dla SR (4, 5). Trzy białka po raz pierwszy oczyszczone z SR to ATPaza wapniowa lub białko pompy wapniowej odpowiedzialne za pompowanie wapnia do światła SR podczas relaksacji (6); kalsekwestryna, białko wiążące wapń o niskim powinowactwie, które znacznie zwiększa pojemność światła SR dla wapnia (7); oraz receptor ryanodynowy (RyR), odpowiedzialny za uwalnianie wapnia podczas aktywacji mięśnia (przegląd patrz ref 8). Później okazało się, że wszystkie typy komórek zawierają specyficzne dla danej komórki formy i/lub analogi tych trzech białek, które są odpowiedzialne za gospodarkę wapniową. We wszystkich komórkach białka te mają tendencję do grupowania się razem. SR jest więc rozległą, wyspecjalizowaną domeną ER komórek mięśniowych. I odwrotnie, wszystkie komórki zawierają wyspecjalizowane domeny podobne do SR, ale w znacznie mniejszych ilościach. Niektóre komórki nie-mięśniowe, takie jak komórki Purkinjego w móżdżku, posiadają rozległe domeny SR-podobne, zawierające specyficzne dla mięśni izoformy RyRs i kalsequestryny (9, 10).
Jak napisał Porter w swoim niepowtarzalnym stylu: specyficzny „precyzyjny morfologiczny związek siateczki z miofibrylami…. skłania do sugestii, że system ten jest funkcjonalnie ważny w skurczu mięśnia.” Zrozumienie specyficznej roli SR w kontroli skurczu mięśnia zostało ukształtowane przez krytyczne publikacje w ekscytującym okresie, który bezpośrednio poprzedzał i następował po opisie SR przez Portera. Lokalne eksperymenty stymulacyjne A. F. Huxley’a, przeprowadzone na przełomie lat pięćdziesiątych i sześćdziesiątych, wskazały na obecność specyficznej drogi umożliwiającej rozprzestrzenianie się impulsu elektrycznego do wnętrza włókna, a tym samym dostarczyły kluczowego związku pomiędzy depolaryzacją powierzchniową a szybką aktywacją centralnie położonych miofibryli (patrz ref. 11). Praca A. Webera z 1959 roku była pierwszym dowodem na to, że jony wapnia, obecnie w pełni rozpoznawane jako ogólne przekaźniki wewnątrzkomórkowe, są odpowiedzialne za kontrolę skurczu mięśni (12). S. Ebashi i A. Weber wpłynęli na siebie nawzajem, przemierzając kontynenty, w konstruowaniu jasnych dowodów na to, że zdolność SR do wyłapywania wapnia w pełni odpowiada za relaksację, podczas gdy W. Hasselbach precyzyjnie zdefiniował działanie pompujące wapń w SR (patrz ref. 13 dla przeglądu).
Podążając za L. D. Peachey’em w laboratorium Portera, byłem w pełni świadomy poszukiwań, zapoczątkowanych przez wyniki A. F. Huxely’ego, połączenia między plazmalemmą włókna mięśniowego a jego wnętrzem, które pozwoliłoby na szybkie rozprzestrzenianie się zdarzenia elektrycznego do wnętrza włókna (14). W swojej pracy z 1957 roku (3), Porter i Palade opisali powtarzającą się jednostkę strukturalną, triadę, która znajduje się w precyzyjnej relacji do pasm miofibryli: albo naprzeciwko linii Z, albo naprzeciwko połączenia A-I. Triada składa się z 2 cystern SR ściśle przylegających do centralnej kanalika. Lokalizacja triady (3) i jej centralnej tubuli (15-17) pokrywa się z miejscami, w których dochodzi do rozprzestrzeniania się do wewnątrz skurczów wynikających z lokalnej depolaryzacji (11). Andersson-Cedergren (18), używając skrupulatnych przekrojów seryjnych, wykazał, że centralne elementy triady tworzą ciągłą sieć w poprzek włókien mięśniowych, stąd nazwa tubule poprzeczne (T) dla tych komponentów triady. Tak więc oczy mikroskopistów elektronowych skupiły się na kanalikach T, a ja byłem przygotowany na odkrycie, które powitało mnie pod koniec mojego stażu podoktorskiego w laboratorium Portera (1963). Patrzyłem na cienkie przekroje mięśni szkieletowych gupików hodowanych w zbiornikach Elisabeth Porter i nagle zobaczyłem powtarzające się przykłady szeroko otwartych ujść kanalików T na brzegu włókna. Łatwo było zwrócić na siebie uwagę Portera: Wszedłem do jego laboratorium o 22:00-11:00, zwykle pod koniec jego dnia pracy, kiedy mógł się zrelaksować, i pokazałem mu moje negatywy. Porter od razu wzbudził zainteresowanie. Moje zdjęcia nie spełniały jego wysokich standardów, więc wziął jeden z moich bloków, osobiście wyciął cienkie przekroje i wykonał serię mikrografów, z których każdy był dziełem sztuki (ryc. 1A). Mikrofotografie Portera stanowiły większość ilustracji w końcowej publikacji pokazującej, że kanaliki T mają istotne cechy niezbędne do pełnienia roli w rozprzestrzenianiu depolaryzacji błony powierzchniowej do wnętrza włókna (19, patrz też Ryc. 1B). Ciągłość światła kanalików T z przestrzeniami zewnątrzkomórkowymi została również potwierdzona w tym samym roku poprzez penetrację znaczników przestrzeni zewnątrzkomórkowej (20, 21) oraz barwnika fluorescencyjnego (22). Ciągłość kanalików T z błoną powierzchniową leży u podstaw dużej pojemności powierzchniowej błony włókien mięśniowych.
Domeny funkcjonalne SR są związane albo z błoną powierzchniową, albo z kanalikami T (ryc. 1C, G), tworząc z nimi dobrze zdefiniowane połączenia zwane jednostkami uwalniania wapnia (patrz 23, 24 dla przeglądów). Podczas sprzężenia pobudzenie-skurcz (e-c) błony zewnętrzne ulegają początkowo depolaryzacji, a zaraz potem SR uwalnia wapń do przestrzeni miofibrylarnych. Powstaje zatem pytanie strukturalne: jaka jest relacja pomiędzy SR i błonami zewnętrznymi w tych wyspecjalizowanych miejscach węzłowych, która umożliwia przełożenie zdarzenia elektrycznego na uwolnienie wapnia z SR podczas aktywacji mięśnia? Przeskakując w czasie o ∼ 25 lat, współczesne pytanie strukturalne dotyczące tego etapu w sprzężeniu e-c brzmi: jaka jest przestrzenna relacja pomiędzy białkami SR i zewnętrznych błon w jednostkach uwalniania wapnia i co można wywnioskować z tej asocjacji? Dobrze zidentyfikowano cztery białka węzłowego SR: receptory ryanodynowe (RyRs), czyli kanały uwalniania wapnia SR (8); kalsequestryna (7, 25); triadyna (26); oraz junktyna (27). RyRs są homotetramerycznymi kanałami wapniowymi zbudowanymi z 4 identycznych podjednostek o dużej domenie cytoplazmatycznej i łącznej masie ∼2,000 kDa, które w stanie otwartym umożliwiają szybką ucieczkę wapnia SR do przestrzeni miofibrylarnych. Cytoplazmatyczne domeny RyRs są widoczne w mikroskopie elektronowym jako stopki, które łączą powierzchnię węzłową SR z błonami zewnętrznymi (ryc. 1C, D). RyRs są więc strategicznie zlokalizowane w celu oddziaływania z błoną powierzchniową. Kalsequestryna jest białkiem luminalnym cystern SR, zlokalizowanym w pobliżu domen węzłowych SR (ryc. 1B, C). Jej zadaniem jest zwiększenie całkowitej pojemności wapniowej światła SR, przy jednoczesnym utrzymaniu stosunkowo wysokiego stężenia wolnego wapnia, co umożliwia duży gradient stężenia wapnia jonowego pomiędzy światłem SR a miofibrylami. Triadyna jest prawdopodobnie białkiem, które łączy kalsequestrynę z powierzchnią SR, utrzymując ją w pobliżu RyRs, podobną rolę może pełnić również junktyna. Albo jedno z tych dwóch ostatnich białek, albo inne, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane, jest odpowiedzialne za utrzymywanie kalsequestryny unieruchomionej w pobliżu kanałów uwalniania wapnia. Jedno białko błony powierzchniowej znajduje się w domenach łączących błony zewnętrzne uczestniczące w jednostkach uwalniania wapnia (23): kanał wapniowy typu L, zwany również receptorem dihydropirydynowym (DHPR). DHPR działają zarówno jako czujniki napięcia, jak i kanały wapniowe, a ich działanie jest niezbędne do zainicjowania uwalniania wapnia z SR (28, 29).
W mięśniach szkieletowych DHPR są zgrupowane w tetrady, czyli grupy 4 elementów zlokalizowanych w narożach małych kwadratów (ryc. 1E, I). Tetrady DHPR tworzą uporządkowane tablice, które licują z uporządkowanymi tablicami stóp SR w taki sposób, że każdy z 4 DHPR tworzących tetrad wydaje się być połączony z podjednostką stopy podstawowej (30, 31). Ta bezpośrednia strukturalna relacja 2 głównych białek jednostek uwalniania wapnia pomaga wesprzeć tzw. „mechaniczną” hipotezę sprzężenia e-c, proponującą, że czujniki napięcia w błonie kanalika T (później wykazano, że są to DHPR) wyczuwają depolaryzację i wpływają na uwalnianie wapnia z SR poprzez bezpośrednią interakcję molekularną (32). Jedną z zastanawiających obserwacji strukturalnych dotyczących relacji DHPR-RyR jest to, że tetrady są związane z naprzemiennymi stopami (ryc. 1 M), pozostawiając zestaw sierocych stóp (lub RyRs), które nie są bezpośrednio związane z DHPRs. Praca porównawcza na różnych mięśniach in vivo i in vitro wskazuje, że naprzemienna dyspozycja jest regułą dla mięśni szkieletowych i nie zależy od obecności 2 typów izoform RyR.
Ostatnie badania nad molekularnymi i rozwojowymi podstawami relacji DHPR-RyR są dziełem dwóch stypendystów podoktorskich w moim laboratorium (dr Hiroaki Takekura i Feliciano Protasi) i obejmują współpracę z dr P. D. Allenem, K. G. Beamem, B. E. Flucherem i H. Takeshimą. Pierwszym pytaniem, nad którym się zastanawialiśmy było to, w jaki sposób naprzemienne rozmieszczenie tetrad jest wytwarzane podczas rozwoju skrzyżowań. Kwestia ta została zbadana we współpracy z dr B.E. Flucher przy użyciu komórek pochodzących z mięśni szkieletowych w linii komórkowej BC3H1, które rozwijają współlokowane skupiska DHPRs, triadyny i RyRs na peryferiach komórek (33). Cienkie przekroje i liofilizacja tych komórek wykazują dobrze zróżnicowane jednostki uwalniania wapnia zawierające rozległe uporządkowane tablice stóp i tetrad. Tetrady mają naprzemienne rozmieszczenie. Wiele z połączeń ma tetrady z brakującymi elementami, a ponieważ znajdujemy je zarówno we wczesnych, jak i późnych dniach hodowli, zakładamy, że wiele z nich reprezentuje połączenia w procesie formowania. Co ciekawe, nawet gdy są one niekompletne, tablice tetrad mają zmienną dyspozycję w stosunku do tablic stóp, co wskazuje, że ta relacja jest nieodłącznie związana z interakcjami między tymi dwoma białkami.
Drugie pytanie dotyczy tego, czy grupowanie DHPRs w tetrady jest unikalne dla mięśni szkieletowych, czy też jest obecne w mięśniach, które wydają się mieć inną podstawę dla sprzężenia e-c. Mięsień sercowy zawiera izoformy RyRs i DHPRs różne od tych z mięśnia szkieletowego, a różnią się one funkcjonalnie w tym sensie, że przenikanie wapnia przez DHPRs wydaje się być warunkiem koniecznym dla sprzężenia e-c (34, 35). DHPRs i RyRs mięśnia sercowego są zlokalizowane w miejscach, które wydają się kolokalizować na poziomie mikroskopu świetlnego (ryc. 1F), podobnie jak w mięśniu szkieletowym, a to zestawienie jest osiągane we wczesnym etapie różnicowania aparatu sprzężenia e-c (36-38). Liofilizacja pokazuje jednak, że rozmieszczenie DHPRs w mięśniu sercowym jest odmienne od tego w mięśniu szkieletowym (porównaj Ryc. 1I, K). DHPRs znajdują się w pobliżu stóp, ale nie wydają się być z nimi bezpośrednio połączone (ryc. 1N), tak więc ich interakcja może być pośrednia, poprzez przekaźnik (np. wapń).
Powyższe informacje mają bezpośrednie znaczenie dla zrozumienia 2 modeli mysich służących do badania sprzężenia e-c. W jednym z modeli brakuje głównej (α1) podjednostki DHPR szkieletowych. Mięśnie nie kurczą się z powodu braku sprzężenia e-c i rozwijają się słabo (stąd określenie dysgeniczne). Powstają jednak triady zawierające układy stóp, co wskazuje, że obecność RyRs nie jest konieczna do tworzenia połączeń SR-powierzchnia. W dysgenicznych komórkach mięśniowych brakuje skupisk DH-PRs (wykrywanych przez immunolabeling) i tetrad DHPR (wykrywanych przez liofilizację), ale są one przywracane przez transfekcję hodowanych dysgenicznych miotub cDNA dla DHPR, wykazując, że tetrady składają się z DHPRs (31, 39, 40). Drugim modelem jest celowana mutacja null RyR typu szkieletowego, która również powoduje blokowanie sprzężenia e-c. Włókna mięśniowe pozbawione RyR, nieoczekiwanie, tworzą triady (41) (ryc. 1H). Triady te nie mają stóp, stąd określenie dyspedyczne, ale poza tym na cienkich przekrojach wyglądają normalnie. Linia komórkowa (1B5) rozwinięta z mutacji dyspedycznej również pozbawiona jest sprzężenia e-c. Używając tych komórek, wykazaliśmy, że pomimo braku stóp, połączenia dyspedyczne SR-powierzchnia są formowane i zawierają triadyny i DH-PR (42). Jednakże, w liofilizacji skupiska DHPR zlokalizowane w połączeniach dyspedycznych nie agregują w tetrady (Fig. 1L). Ekspresja cDNA kodującego RyR typu 1 dla mięśni szkieletowych w komórkach 1B5 powoduje powstawanie peryferyjnie zlokalizowanych plamek RyR (ryc. 1P) oraz grupowanie się DHPR w tetrady (ryc. 1Q). Tak więc DHPR nie potrzebują obecności RyRs, aby grupować się w miejscach połączeń SR-powierzchni, ale potrzebują interakcji ze szkieletowymi RyRs, aby tworzyć tetrady. To również pośrednio potwierdza, że we włóknach mięśni szkieletowych istnieje związek pomiędzy RyR i DHPR. I odwrotnie, brak tetrad w mięśniu sercowym wskazuje, że albo nie ma połączenia RyR-DHPR, albo jest ono inne niż w mięśniu szkieletowym. Zarówno obecność połączenia RyR-DHPR, jak i jego brak lub różnica mają głębokie implikacje funkcjonalne dla sprzężenia e-c. K. R. Porter pochwaliłby te osiągnięcia w naszym rozumieniu SR, ponieważ są one oparte na precyzyjnie definiowalnych zależnościach struktura-funkcja.