2.1. Właściwości wzrostu S. boulardii
Aby dokładniej scharakteryzować te drożdże, porównano ich właściwości wzrostu w różnych temperaturach z innymi diploidalnymi szczepami drożdży (wszystkie użyte szczepy drożdży są podsumowane w Tabeli 1). S. boulardii (nazwę tę będę stosować w tekście, mimo że jest to szczep S. cerevisiae) rośnie dobrze na bogatej pożywce w temperaturze 30°C, jak również w 37°C, ale nie w 40°C (Rysunek 1A). Wzrost w 37°C – choć nie idealny – nie jest rzadkością dla szczepów drożdży takich jak diploidalny szczep BY4743 (pochodna S288C), ale w przeciwieństwie do diploidalnego szczepu RH2585/2586 (pochodna Σ1278b), który prawie nie rośnie w 37°C (Rysunek 1A). W tym sensie, wzrost w 37°C nie jest szczególną i unikalną właściwością S. boulardii. Prawdopodobnie raczej odzwierciedla jego przystosowanie do gorącego klimatu, takiego jak ten często spotykany w Indochinach.
| Nazwa i właściwości diploidalnego szczepu drożdży | Właściwości auksotroficzne/odporność na antybiotyki właściwości/oporność na antybiotyki |
|---|---|
| BY4743 | Wymaga histydyny, leucyny, metioniny i uracylu |
| RH2585/2586 | Wymaga histydyny i uracylu |
| RH2585/2586 ∆flo8::kanX ∆flo8::NATR | Brak wymagań; G418- i NAT-resistant |
| S. boulardii | None |
| S. boulardii ∆flo8::kanX ∆flo8::NATR | Brak wymagań; G418- i NAT-resistant |
| S. boulardii ∆rem1::kanX ∆rem1::NATR | Nie ma wymagań; G418- i NAT-resistant |
| S. boulardii ∆his3::kanX ∆his3::NATR | Wymaga histydyny; G418- i NAT-resistant |
| S. boulardii ∆ade2::kanX ∆ade2::NATR | Wymaga adeniny; G418- i NAT-resistant |
Tabela 1.
Diploidalne szczepy drożdży użyte w niniejszej pracy.
G418/genetyna i NAT/nourseothricin są antybiotykami selektywnymi dla szczepów drożdży.
Rysunek 1.
Właściwości S. boulardii i innych diploidalnych szczepów drożdży (wszystkie wymienione w Tabeli 1). (A) Porównanie wzrostu szczepów drożdży w różnych temperaturach. Wskazane szczepy drożdży zostały rozprowadzone na płytkach YPD i inkubowane we wskazanych temperaturach (30, 37, i 40°C) przez 2 dni; (B) Właściwości filamentacyjne różnych szczepów drożdży. Szczepy RH2585/2586, RH2585/2586 ∆flo8::kanX ∆flo8::NATR i S. boulardii inkubowano na płytkach SLAD (50 μM siarczan amonu) przez 1 dzień w temperaturze 30°C, a poszczególne kolonie wzrostowe wizualizowano pod mikroskopem (panel górny: powiększenie 20×; panel dolny: powiększenie 100×); (C) wzrost S. boulardii na różnych podłożach. S. boulardii (#1785) oraz pochodne ∆∆his3 (#1811) i ∆∆ade2 (#1812) hodowano przez 2 dni w 30°C na minimalnej pożywce SD (lewa płytka) lub na YPD + G418 i nourseothricin (obie w końcowej dawce 100 μg/ml) (prawa płytka). Zaznaczyć charakterystyczny różowawy kolor szczepu #1812 spowodowany delecją obu kopii genu ADE2.
Kolejną badaną właściwością S. boulardii jest potencjalna zdolność do tworzenia filamentów. W tym celu wyhodowano go na płytkach SLAD, które zawierają jedynie ograniczające stężenie siarczanu amonu (50 μM, około 1000 razy mniej niż konwencjonalna pożywka minimalna SD). Jak zaobserwowano pod mikroskopem, diploidalny szczep RH2585/2586 wyraźnie wykazuje właściwości filamentacyjne w takich warunkach ograniczających stężenie amonu (Rysunek 1B). Delecja genu FLO8 kodującego czynnik transkrypcyjny wymagany do tworzenia filamentów i adhezji całkowicie zlikwidowała jego właściwości nitkowate. Flo8 jest wymagany do ekspresji, na przykład, Flo11, glikoproteiny powierzchniowej komórki. W przeciwieństwie do RH2585/2586, S. boulardii prawie nie wykazywał właściwości filamentacyjnych. Co ciekawe, sekwencjonowanie amplifikowanego PCR genu FLO8 S. boulardii wykazało, że nie zawiera on przedwczesnego kodonu stop (nie pokazano) występującego w szczepach drożdży niefilamentujących, jak te pochodzące z S288C. Tak więc, inne geny up- lub downstream wymagane do filamentacji są prawdopodobnie dysfunkcjonalne w S. boulardii. Brak filamentacji prawdopodobnie wyjaśnia jego niską toksyczność i brak zdolności do osiedlania się w przewodzie pokarmowym, co w przeciwnym razie mogłoby uczynić go bardziej trwałym i tym samym bardziej problematycznym dla zastosowań medycznych.
Innym interesującym zagadnieniem było indukowanie mejozy i sporulacji w S. boulardii w celu uzyskania haploidalnego potomstwa. W tym celu diploidalne komórki inkubowano w płynnym podłożu z ograniczeniem azotu i bardzo wysokim stężeniem octanu potasu jako (ubogiego) źródła węgla. Mimo kilku prób nie udało się zaobserwować tworzenia tetrad. Pod tym względem S. boulardii wykazuje podobne właściwości jak RH2585/2586 (diploid filamentujący użyty w tej pracy), który nie tworzy tetrad po traktowaniu w opisanych warunkach. W celu indukcji mejozy i sporulacji, wytworzono podwójny nokaut RME1 (Regulator of Meiosis 1) w S. boulardii. RME1 jest negatywnym regulatorem mejozy, który zapobiega ekspresji białek wymaganych do mejozy, takich jak IME1 (Inducer of Meiosis 1) i promuje mitozę. Pochodna S. boulardii ∆∆rme1 nie wykazywała żadnych różnic fenotypowych w stosunku do rodzicielskiego szczepu typu dzikiego pod względem temperatury wzrostu (Figura 1A). Niestety, z tego szczepu knockout również nie uzyskano tetrad. Wnioskuję, że S. boulardii nie ulega mejozie i nie tworzy haploidalnych tetrad, przynajmniej w warunkach laboratoryjnych stosowanych tutaj.
Jak pokazano na Figurze 1C, S. boulardii nie posiada żadnych markerów auksotroficznych, ponieważ rośnie dobrze na podłożu minimalnym (SD) pozbawionym aminokwasów lub składników kwasów nukleinowych, takich jak adenina czy uracyl. Geny markerów auksotroficznych można było łatwo uzyskać poprzez delecje genów ADE2 (biosynteza adeniny) lub HIS3 (biosynteza histydyny) (Rysunek 1C). Delecje te uzyskano przez wprowadzenie dominujących genów markerów auksotroficznych, które zapewniają oporność na antybiotyki kanamycynę/G418 lub nourseotrycynę. Delecja pojedynczej kopii genu ADE2 lub HIS3 nadal pozwalała na wzrost na płytkach z podłożem minimalnym (nie pokazano), wskazując na wyraźnie diploidalny charakter tych drożdży. Dopiero podwójna delecja obu kopii genów HIS3 lub ADE2 (co uczyniło szczep opornym zarówno na kanamycynę/G418 jak i nourseotricynę; Rysunek 1C) uczyniła ten szczep drożdży auksotroficznym dla histydyny lub adeniny. Nowo uzyskana auksotrofia histydyny została wykorzystana w kolejnym eksperymencie do transformacji tego szczepu plazmidami drożdżowymi niosącymi HIS3 jako gen markera selekcyjnego (patrz dalszy tekst).