Calibração são usadas para compreender a resposta instrumental a uma substância a analisar, e para prever a concentração da substância a analisar numa amostra.
Uma curva de calibração é criada preparando primeiro um conjunto de soluções padrão com concentrações conhecidas da substância a analisar. A resposta instrumental é medida para cada uma, e traçada versus a concentração da solução padrão. A parte linear deste gráfico pode então ser utilizada para prever a concentração de uma amostra da substância a analisar, através da correlação da sua resposta à concentração.
Este vídeo irá introduzir curvas de calibração e a sua utilização, demonstrando a preparação de um conjunto de padrões, seguida da análise de uma amostra com concentração desconhecida.
Um conjunto de soluções padrão é utilizado para preparar a curva de calibração. Estas soluções consistem numa gama de concentrações que englobam a concentração aproximada da substância a analisar.
Soluções-padrão são frequentemente preparadas com uma diluição em série. Uma diluição em série é realizada preparando primeiro uma solução de reserva da substância a analisar. A solução de reserva é então diluída por uma quantidade conhecida, frequentemente uma ordem de grandeza. A nova solução é então diluída da mesma maneira, e assim por diante. Isto resulta num conjunto de soluções com concentrações que variam em várias ordens de magnitude.
A curva de calibração é um gráfico de sinal instrumental vs. concentração. O traçado dos padrões deve ser linear, e pode ser ajustado com a equação y=mx+b. As parcelas não lineares do gráfico devem ser descartadas, pois estas gamas de concentração estão fora do limite de linearidade.
A equação da linha de melhor ajuste pode então ser usada para determinar a concentração da amostra, usando o sinal do instrumento para se correlacionar com a concentração. As amostras com medições que se encontram fora da gama linear da parcela devem ser diluídas, de modo a estarem na gama linear.
O limite de detecção do instrumento, ou a medição mais baixa que pode ser estatisticamente determinada sobre o ruído, também pode ser calculada a partir da curva de calibração. Uma amostra em branco é medida várias vezes. O limite de detecção é geralmente definido como o sinal em branco médio mais 3 vezes o seu desvio padrão.
Finalmente, o limite de quantificação também pode ser calculado. O limite de quantificação é a menor quantidade de substância a analisar que pode ser quantificada com precisão. Isto é calculado como 10 desvios padrão acima do sinal em branco.
Agora que tenha aprendido as bases de uma curva de calibração, vamos ver como preparar e utilizar uma no laboratório.
P>Primeiro, prepare uma solução de reserva concentrada do padrão. Pesar com precisão o padrão, e transferi-lo para um balão volumétrico. Adicionar uma pequena quantidade de solvente, e misturar de modo a que a amostra se dissolva. Em seguida, preencher a linha com solvente. É importante utilizar o mesmo solvente que a amostra.
Para preparar os padrões, pipetar a quantidade necessária no balão volumétrico. Em seguida, encher o frasco até à linha com solvente, e misturar.
Continuar a preparar os padrões pipetando a partir da solução de reserva e diluindo. Para uma boa curva de calibração, são necessárias pelo menos 5 concentrações.
Agora, executar amostras com o instrumento analítico, neste caso um espectrofotómetro UV-Vis, a fim de determinar a resposta instrumental necessária para a curva de calibração.
Realizar a medição do primeiro padrão. Executar os padrões em ordem aleatória, no caso de haver erros sistemáticos. Medir cada padrão 3-5x para obter uma estimativa do ruído.
Medir o resto dos padrões, repetindo as medições para cada um. Registar todos os dados.
Finalmente, executar a amostra. Utilizar a mesma matriz de amostra e condições de medição que foram utilizadas para as normas. Certifique-se de que a amostra está dentro da gama dos padrões e do limite do instrumento.
Para construir a curva de calibração, use um programa de computador para traçar os dados como sinal vs. concentração. Utilizar o desvio padrão das medições repetidas para cada ponto de dados para fazer barras de erro.
Remover partes da curva que não sejam lineares, depois executar uma regressão linear e determinar a linha mais adequada. A saída deve ser uma equação na forma y = m x + b. Um valor R2 próximo de 1 denota um bom ajuste.
Esta é a curva de calibração para o corante azul #1, medido a 631 nm. A resposta é linear entre 0 e 15 mM.
Calcular a concentração da amostra usando a equação da linha de melhor ajuste. A absorção para a amostra foi de 0,141, e correspondeu a uma concentração de 6,02 mM.
P>Agora já se viu como uma curva de calibração pode ser utilizada com um espectrofotómetro UV-Vis, vejamos algumas outras aplicações úteis.
As curvas de calibração são frequentemente utilizadas com aplicações electroquímicas, uma vez que o sinal do eléctrodo deve ser calibrado à concentração de iões na solução. Neste exemplo, foram recolhidos dados para um eléctrodo selectivo de iões para fluoreto.
Os dados de concentração devem ser traçados na escala de log para obter uma linha. Esta curva de calibração pode ser utilizada para medir a concentração de flúor numa solução, como pasta de dentes ou água potável.
Cromatografia líquida de alto desempenho, ou HPLC, é uma técnica de separação e análise que é fortemente utilizada em química analítica. A HPLC separa componentes de uma mistura com base no tempo necessário para as moléculas percorrerem o comprimento da coluna de cromatografia. Este tempo varia em função de uma gama de propriedades químicas das moléculas.
A eluição das moléculas é medida utilizando um detector, resultando num cromatograma. A área do pico pode ser correlacionada à concentração utilizando uma curva de calibração simples de uma gama de soluções padrão, como neste exemplo de ingredientes populares de soda.
Em alguns casos, em que a matriz da solução interfere com a medição do soluto, uma curva de calibração clássica pode ser imprecisa. Nesses casos, é preparada uma curva de calibração modificada. Para isso, adiciona-se uma gama de volumes de solução padrão à amostra. É criado o sinal para o gráfico de concentração, onde a intercepção x é igual à concentração original da solução da amostra. Para mais detalhes sobre esta técnica, por favor veja o vídeo de educação científica JoVE, “O método da adição padrão”.
Acabou de assistir à introdução do JoVE à curva de calibração. Deve agora compreender onde a curva de calibração é utilizada, como criá-la, e como utilizá-la para calcular concentrações de amostras.
Como sempre, obrigado por assistir!