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Introdução

Doenças auto-imunes representam uma grande variedade de problemas clínicos que afectam múltiplos órgãos e sistemas, e afectam pelo menos 5% da população.1 Uma grande diversidade de anticorpos tem sido associada a diferentes manifestações clínicas e os clínicos têm confiado neles para orientar o diagnóstico clínico, as implicações prognósticas e, em alguns casos, as decisões terapêuticas.2,3 O conhecimento actual sobre patogénese de doenças auto-imunes concorda que é necessária uma interacção complexa de genes e características ambientais para que estes apareçam.4

Combinação do ensaio de immunoblot ENA de linha (INNOLIA-ANA) e técnicas de imunofluorescência indirecta para detectar anticorpos antinucleares em células HEp-2 como substrato são bons métodos de rastreio em doentes com suspeita clínica de uma doença auto-imune, principalmente lúpus eritematoso sistémico (LES) e síndrome de Sjögren (SS). Embora possam ocorrer falsos resultados positivos, os títulos >1:80 sugerem a possibilidade de uma doença auto-imune e deveriam suscitar avaliações mais específicas para determinar as reactividades específicas dos anticorpos antinucleares (ANA), tais como o ADN anti-doença de encalhamento duplo e antigénios nucleares extraíveis (ENA).5

Ro/SSA e La/SSB são complexos antigénicos heterogéneos formados por três proteínas diferentes (Ro-52, Ro-60 e La) e quatro partículas de YRNA. A proteína Ro60 actua como um ponto de verificação de qualidade para o RNA desdobrado com chaperones moleculares para RNAs defeituosos. Os RNAs desdobrados são reconhecidos e depois etiquetados por Ro60 para degradação. Ro52 interage com diferentes moléculas, entre elas a calreticulina e a proteína de ligação da cadeia pesada da imunoglobulina. Pensa-se que Ro52 modifica o papel ou estabilidade dos seus substratos através da ubiquitinação, e esta modificação pode resultar em eventos biológicos mediados por Ro52.6

Anti-Ro/SSA e anticorpos anti-La/SSB foram descritos em várias doenças auto-imunes. Na síndrome de Sjögren primária (pSS) os anticorpos circulantes são detectados em aproximadamente 60-70% dos doentes, e níveis mais elevados têm sido associados ao início precoce da doença e a manifestações sistémicas.7,8 O Grupo de Estudo GEMESS, que incluiu 12 centros de referência em Espanha, confirmou estas características clínicas e laboratoriais numa coorte de doentes com pSS, e observou níveis reduzidos de C4 em doentes com início precoce da doença.9

Anti-Ro/SSA são detectados em 30% dos doentes com diagnóstico de LES, particularmente (90%) os subtipos com lúpus eritematoso cutâneo subagudo, lúpus induzido por drogas e deficiências congénitas de C2, C4 e C1q, também em doentes com síndrome de sobreposição SS/SLE e doença indiferenciada do tecido conjuntivo.10 Em contraste, o anti-La/SSB é mais comumente associado à SS,11 e fortemente correlacionado em anti-La/SSB positivo com anti-Ro/SSA negativo a disfunção orgânica (rim, pulmão, fígado).12

Desde os anos oitenta, o desenvolvimento do bloqueio cardíaco congénito tem sido descrito em doenças auto-imunes, tais como a SS e o LES. No entanto, o envolvimento cardíaco está mais relacionado com anticorpos circulantes da mãe do que com o diagnóstico de doença auto-imune. Embora o perfil imunitário seja variável entre diferentes estudos, o anticorpo anti-Ro52 é mais comum em mães de crianças com bloqueio cardíaco congénito, lúpus neonatal, e recém-nascidos com QT prolongado sem bloqueio cardíaco congénito.10,13,14

Prevalência e associações clínicas de anticorpos anti-Ro/SSA e anti-La/SSB podem variar em diferentes grupos étnicos. Para além dos estudos realizados na população espanhola sobre a expressão imunitária de SS, foram desenvolvidos nos últimos anos outros estudos sobre o perfil imunitário dos doentes com anti-Ro52, anti-Ro60 e anticorpos anti-La. A maioria deles tem sido realizada sobre o diagnóstico específico de doenças do tecido conjuntivo. Numa coorte de doentes com SS desenvolvida na Coreia, foram observadas associações destes anticorpos com diferentes manifestações clínicas. Anti-Ro52 foi o autoanticorpo mais frequente e relacionado com lesões hepáticas e musculares.15 Um estudo recente na população mexicana para determinar a prevalência de SSP no LES recente mostrou a presença de anti-Ro/SSA como preditor de sobreposição, enquanto a ausência de anti-Ro/SSA, anti-La/SSB e factor reumatóide estava relacionada com o menor risco de sobreposição.16 Finalmente, o Hospital Universitário de Ghent propôs um estudo para determinar a distribuição diagnóstica associada ao serotipo de anti-Ro/SSA ou anti-La/SSB em doentes consecutivos encaminhados para o laboratório de reumatologia. O LES foi associado ao anti-Ro60 positivo e isolado anti-La predisposto mais a pSS.17

Compreendemos este estudo para avaliar associações clínicas, laboratoriais e de diagnóstico deste importante subconjunto de anticorpos num hospital em Espanha.

MétodosCentro de investigação

Hospital de Jerez de la Frontera é um centro de especialidade regional localizado no sudoeste de Espanha. Presta serviços clínicos especializados e dispõe de 550 camas. O seu Departamento de Imunologia analisa cerca de 5800 testes de ANA e 1700 testes de immunoblot ENA por ano, numa população de 450.000 habitantes. Entre o seu pessoal de laboratório encontram-se um biólogo e um imunologista que realizam testes especializados para diferentes departamentos. Qualquer médico praticante pode encomendar testes de anticorpos antinucleares mas estes são principalmente solicitados por reumatologistas, seguidos por médicos de cuidados primários, gastroenterologistas, internistas, nefrologistas, pneumologistas e hematologistas.

Amostras

Um registo computorizado dos resultados laboratoriais está disponível desde Junho de 2002. Analisámos retrospectivamente todas as amostras consecutivas que encomendaram o teste ANA de Junho de 2002 a Dezembro de 2012. Soros com título de pelo menos 1:160 por ensaio de imunofluorescência em células HEp-2 (Euroimmun, Alemanha) foram considerados positivos e realizados por um único observador treinado. Os soros com um teste ANA positivo para esta diluição de titulação foram analisados utilizando um ensaio de immunoblot ENA de linha disponível comercialmente (INNO-LIA ANA, Fujirebio, Japão). Este kit fornece um ensaio qualitativo in vitro para auto-anticorpos humanos da classe IgG a 13 antigénios diferentes: RNP-70, RNP-A, RNP-C, Ro-52, Ro-60, La/SSB, Scl-70, CENP-B, histones, Jo-1, Sm, proteína ribosomal P e complexo U1-nRNP em soro ou plasma. A sensibilidade global e especificidade da detecção de autoanticorpos pelo LIA foi semelhante ou superior em comparação com as técnicas convencionais combinadas.18,19 Este immunoblot tem 99,6% de especificidade ao anti-La, enquanto que o anti-Ro60 tem 98,2%, e o anti-Ro52 tem 98,3%.20

Outras vezes o sistema informático permite-nos detectar no imunoensaio anti-Ro e/ou anti-La positivo com teste de ANA negativo, porque em doentes com elevada suspeita clínica de uma doença auto-imune o ensaio de immunoblot ENA foi realizado apesar de um teste de ANA negativo. Finalmente, apenas foram incluídos no estudo pacientes com mais de uma amostra de soro positivo para anti-Ro/SSA ou anti-La/SSB.

Dados clínicos e laboratoriais foram obtidos ou por dois observadores treinados através da revisão de fichas clínicas ou de uma base de dados laboratoriais informatizada.

Variáveis

Variáveis independentes incluíram demografia (idade, sexo), clínica (diagnóstico, características da doença), laboratorial (hemoglobina, contagem de leucócitos e plaquetas, níveis de hormona tiróide) ou imunológica (níveis de complemento, hipergamaglobulinemia, factor reumatóide).

Análise estatística estatística

Estatística descritiva foi utilizada com frequências e percentagens para variáveis qualitativas e médias, desvio padrão, e intervalo para variáveis quantitativas. As associações clínicas entre diferentes conjuntos de combinações positivas contra variáveis clínicas ou laboratoriais foram analisadas através de tabelas de contingência utilizando o quadrado de chi dos testes exactos de Fisher. Em todos os casos, o nível alfa foi fixado em 0,01 como ajuste para comparações múltiplas. A força de associação é apresentada como odds ratio e os seus intervalos de confiança de 99%. Efectuámos a análise de agregados de variáveis utilizando a ligação média entre grupos, e utilizando como medida de intervalo, a distância Euclidiana ao quadrado. As análises foram realizadas utilizando SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultados

Um total de 41.102 amostras de soro foram encaminhadas para o Departamento de Imunologia para detecção de ANA. 12.124 amostras foram positivas de 2970 pacientes. 322 doentes com mais de uma amostra de soro positivo para anti-Ro52 e/ou anti-Ro60 e/ou anticorpos anti-La com diluição de titulação >160 foram incluídos. As fêmeas representaram 90,4% da amostra. Tinham uma idade entre 10 e 84 anos, média 44,4 e desvio padrão de 15,7 anos. Alguns soros isolados foram positivos para o ensaio de immunoblot ENA com teste de ANA negativo. Mas os 322 doentes apresentaram todos ou a maioria dos seus soros positivos para o teste de ANA, e o padrão dos soros para cada doente era praticamente idêntico. Nenhum paciente foi encontrado no nosso estudo com mais de um soro negativo para IIF.

Dados clínicos e laboratoriais principais de pacientes com amostras positivas para anti-Ro52 e/ou anti-Ro60 e/ou anti-La (322 casos) são apresentados na Tabela 1. As especificidades dos diferentes antigénios destes doentes estão representadas no Quadro 2. Podemos ver que o resultado positivo mais frequente foi anti-Ro52 em 269 doentes (83,5%), seguido por 205 doentes com anti-Ro60 (63,7%) e 155 com anti-La (48,1%).

Table 3 mostra diferentes associações entre combinações de anticorpos anti-Ro52/anti-Ro60/anti-La e resultados de diagnóstico, clínicos ou laboratoriais. A tabela 4 mostra associações significativas de teste positivo para a presença de anticorpos circulantes anti-Ro52, anti-Ro60 e anti-La. Uma vez que foi seleccionado um nível de significância rigoroso, algumas associações interessantes não foram apresentadas, tais como o grupo anti-Ro52+ com padrão citoplasmático (OR 3,72, 99% CI: 0,9-16, valor de p 0,04) e o grupo anti-Ro60+ com lúpus cutâneo subagudo (SCLE) (OR 7,0, 99% CI: 0,9-55,3, p: 0,023).

Utilizando análise de agrupamento, podem ser identificados quatro grupos de auto-anticorpos. O agrupamento 1 inclui anticorpos contra SmB, SmD, RNP,70, RNP-A e RNP-C. O cluster 2 é formado para anticorpos contra Scl-70, Ribosomal P, Jo1 e centrómero. O Cluster 3 é formado para anticorpos contra Ro60 e SSB. O Cluster 4 consiste em anticorpos contra Ro52 (Fig. 1).