História
A clonagem de gado começou no nosso laboratório em 1986 com a introdução de células doadoras nucleares em fase de clivagem embrionária em oócitos enucleados de metáfase II, resultando na gravidez e nascimento de dois vitelos saudáveis (Prather et al., 1987). O nosso sucesso e sucesso na Granada Genetics quase na mesma altura foram possíveis por vários factores. Estudos em anfíbios mostraram um desenvolvimento mais avançado a partir da transferência de núcleos para oócitos enucleados em metafase, em vez de zigotos pronucleados (Hoffner e DiBerardino, 1980). Evidências de estudos com ratos demonstraram que a frequência de desenvolvimento após a transferência nuclear (NT) era muito maior quando os núcleos eram fundidos em oócitos de ratos em vez de microinjectados (McGrath e Solter, 1983). Os estudos de Willadsen (1986) em ovelhas mostraram que os cordeiros podiam ser produzidos por electrofusão de células estaminais embrionárias em oócitos enucleados de metáfase II. O aparecimento de métodos de produção de embriões in vitro e de cultivar embriões até à fase blastocisto também facilitou o advento da clonagem de bovinos, uma vez que os embriões bovinos eram geralmente transferidos para vacas na fase blastocisto para produzir descendentes (First, 1990; Gordon, 1994; Fulka et al., 1998).
Células estaminais embrionárias derivadas até ao estádio de mórula foram utilizadas para transferência para oócitos enucleados em metafase nestes primeiros estudos porque a literatura anfíbia inicial sugeria que as células estaminais embrionárias eram totipotentes mas que as células somáticas ou diferenciadas fetais não o eram (DiBerardino, 1988; DiBerardino, 1997). Isto foi confirmado em mamíferos por estudos como o de Navara et al. (1994). Neste estudo, células de linhagem polarizada e de trofoblasto foram utilizadas como dadores nucleares e resultaram em muito poucos embriões em fase de blastocisto (7%; n=158), enquanto que células não polarizadas e não diferenciadas utilizadas como dadores nucleares produziram uma alta frequência de blastocistos (47%; n=184). Em comparação, 30% dos 139 embriões não seleccionados desenvolveram-se até à fase de blastocistos. A conclusão nos anos 80 de que apenas os tipos de células não diferenciadas eram eficazes em termos de desenvolvimento como dadores nucleares deve-se à grande limitação técnica de que os métodos artificiais eram incapazes de activar os oócitos tão rápida e eficazmente como o esperma (Ware et al., 1989). Isto forçou a utilização de oócitos envelhecidos, que tinham perdido a capacidade de reprogramar um núcleo diferenciado. Uma comparação de oócitos jovens e idosos é mostrada no Quadro 20.1 do Primeiro Laboratório. De facto, com muitos protocolos iniciais, o melhor sucesso foi alcançado quando o oócito foi tão envelhecido que o envelope nuclear de células doadoras e o seu conteúdo foi retido no toto sem ruptura do envelope nuclear (Saeki et al., 1991; Leibfried-Rutledge et al., 1992; Poccia e Collas, 1997). Oócitos moderadamente envelhecidos permitiriam a quebra do envelope nuclear, mas rapidamente reagrupariam o envelope nuclear e excluíriam parte da cromatina do núcleo.
Table 20.1. Utilização de Oócitos Jovens versus Idosos na Transferência Nuclear
| Processamento | 24 Horas | 48 Horas |
|---|---|---|
| Artificial activação | Poor | Excellent |
| Descarga e remontagem de envelope nuclear | Sim | Não |
| Essential | Nonessential | |
| Célula e genómica reprogramação da célula doadora | Sim | Não |
| Sequência e tempo de activação | Crítica | Não crítico |
| Brionário totipotente |
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A capacidade de activar jovens oócitos bovinos surgiu através do desenvolvimento de procedimentos que suprimiram mais completa e continuamente a actividade da metafasefactor de promoção (MPF) e factor citostático (CSF), em comparação com os ionóforos Ca2+ (Liu e Yang, 1999). O MPF é testado pela actividade da quinase H1 e o CSF é testado pela actividade da proteína cinase activada por mitogénio (MAPK); juntos mantêm os oócitos metafásicos em paragem meiótica. Esta capacidade de activar oócitos jovens forneceu a base para o aproveitamento da capacidade dos oócitos da metáfase II para reprogramar células doadoras nucleares fetal ou somáticas na NT. Um desses procedimentos é a activação de oócitos jovens de metáfase II com um ionóforo de cálcio, seguido de uma exposição de 4 a 6-h à 6-dimetilaminopurina (6-DMAP) para interferir com a fosforilação de resíduos de serina e treonina em MPF e MAPK (Susko-Parrish et al., 1994). Outro método utiliza butrolactona para o mesmo fim (Motlik et al., 1998; Motlik et al., 2002). Um estudo da associação de MPF, MAPK, e da dinâmica da progressão nuclear durante a activação de oócitos bovinos jovens e idosos sugeriu que a inactivação de MPF e MAPK são pré-requisitos para a libertação da prisão em metafase e formação de pronúcleos em oócitos bovinos (Tian et al., 2003). Jang et al. (2005) compararam a competência de desenvolvimento de embriões de transferência nuclear de células somáticas (SCNT) reconstruídos com diferentes células doadoras e a expressão genética analisada no embrião resultante.
Ativação também pode ser conseguida através da inibição da síntese proteica com cicloheximida (CHX) após um tratamento ionóforo, seguido de incubação com citochalasina B (CB) para prevenir a extrusão de cromatina da célula e assim manter um estado diplóide (Liu e Yang, 1999). Bhak et al. (2006) estudaram a taxa de desenvolvimento e ploidia dos embriões produzidos por NT com diferentes tratamentos de activação em bovinos. Neste estudo, foram comparados três métodos de activação de oócitos, nomeadamente, apenas ionomicina, ionomicina+DMAP, e ionomicina, e CHX para o desenvolvimento de embriões produzidos por SCNT a partenotas e IVF homólogos. Os resultados sugerem que o tratamento com DMAP após ionomicina aumenta grandemente as taxas de desenvolvimento de partenotas, mas não diferiu no desenvolvimento de blastocistos em comparação com o tratamento com CHX. No entanto, o tratamento com DMAP aumentou a taxa de clivagem dependente do tempo para embriões em duas fases celulares. Além disso, aumentou consideravelmente a incidência de anomalias cromossómicas em embriões de partenotas e de SCNT. Bhak et al. (2006) concluíram que o CHX combinado com ionomicina é mais desejável do que o DMAP para a activação de oócitos durante a TN no gado. A desidroleucodina (DhL) foi avaliada como activador químico de oócitos bovinos e embriões reconstituídos de SCNT (Bhak et al., 2006). Mais recentemente, DhL foi avaliada como activador químico de oócitos bovinos e embriões reconstituídos de SCNT (Canel et al., 2010). Os oócitos foram activados com doses baixas e altas de ionomicina e expostos a doses baixas e altas de DhL sozinhos ou, alternadamente, combinados com CB. Os resultados mostraram que a DhL induz uma dinâmica de formação pronuclear mais semelhante aos embriões produzidos por FIV do que o DMAP e baixos níveis de DhL facilitam o desenvolvimento de blastocistos. Estes resultados indicam que um baixo nível de DhL1 combinado com uma longa exposição ao protocolo CB poderia ser útil para programas SCNT (Canel et al.., 2010).
Desenvolvimento de blastocistos após fertilização in vitro ou NT foi ainda melhorado com a descoberta de que os primeiros oócitos a atingirem a metafase II aproximadamente 16 h após a remoção do folículo, quando inseminados 8 h mais tarde, produziram uma frequência muito mais elevada de blastocistos do que os embriões obtidos a partir de oócitos amadurecem às 24 h (Dominko e First, 1997). A capacidade de produzir oócitos jovens altamente competentes que podiam ser activados precocemente permitiu-nos produzir blastocistos, gravidezes, e descendentes de massa celular interna de blastocistos que tinham sido cultivados, multiplicados, e passados durante quatro a seis passagens (First et al., 1994; Sims e First, 1994). A eficiência não foi elevada; aproximadamente 15% das NTs produziram blastocistos e quatro bezerros resultaram de 34 transferências de embriões. A tipagem de ADN destes bezerros confirmou que a sua identidade correspondia às linhas celulares de onde foram derivados (First et al., 1994). A eficiência do NT foi maior quando foram utilizados blastómeros em fase de clivagem ou células mórulas no modelo de oócitos envelhecidos. Mais recentemente, Kwun et al. (2003) mostraram que a cultura de embriões produzidos in vitro ou NT se desenvolveu até ao estádio normal de blastocisto a uma taxa mais elevada na presença de uma combinação de frutose e glucose. Este grupo concluiu que a frutose poderia ser um substrato energético mais eficiente do que a glicose para produzir um grande número de blastocistos transferíveis derivados de SCNT (Kwun et al., 2003). Uma alternativa à fusão do núcleo de uma célula num oócito enucleado em vez de por micro agulha ou electrofusão é a utilização de vírus fusogénicos inactivados para inserir o núcleo da célula no oócito enucleado, tal como foi apresentado e revisto por Rodríguez et al. (2008). Com este método, uma meia casca de um oócito enucleado tem um núcleo doador colocado sobre ele com outra meia casca de oócito fundida sobre ele. Isto resultou em 65,7% dos oócitos tornarem-se blastocistos quando o núcleo veio de uma célula somática adulta e 38,2% quando o núcleo doador veio de uma célula fetal (Rodríguez et al.., 2008).
Até 1993, centenas de bezerros tinham sido produzidos a partir de NT utilizando células embrionárias como doadoras nucleares. Até à data, este número tem aumentado, mas não exponencialmente como seria de esperar. O sucesso do NT requer o apagamento completo da impressão genómica e do estado de metilação e a reprogramação perfeita do genoma da célula doadora. O genoma reprogramado deve manter a sua estabilidade ao longo do desenvolvimento e finalmente resultar numa descendência viável com órgãos normalmente diferenciados. A reclonagem foi realizada, e foram utilizadas células doadoras congeladas, órgãos congelados sem crioprotector, bem como oócitos in vitro-maduros (Stice e Keefer, 1993; Barnes et al., 1993). Na melhor das hipóteses, 20-50% das NTs resultaram em blastocistos para transferência para vacas, dos quais aproximadamente 50% se tornaram prenhezes. No entanto, as perdas de gravidez são maiores do que o normal, com até 20% a falhar o parto e a exigir a indução do parto, resultando frequentemente em vitelos maiores do que o normal (Rodriguez-Osorio et al., 2009, 2012; Oback e Wells, 2007; Cibelli, 2007; Niemann et al., 2008; Kato et al., 1998; Oback 2009).
As empresas comerciais tentaram melhorar a eficiência da clonagem embrionária a um nível e custo adequados para a produção de gado comercial. Infelizmente, ainda não foi atingido um nível suficiente de eficiência. No gado leiteiro, a produção de clones embrionários de gado de alta produção de leite requeria a criação para a produção de leite e depois a selecção de linhas clonais embrionárias de alta produção de leite. O interesse comercial na clonagem embrionária desapareceu com o advento da clonagem a partir de células germinais primordiais e linhas de células somáticas fetais ou adultas. Há ainda tentativas de cultura de células estaminais embrionárias bovinas em números suficientemente grandes para transferência genética e selecção de colónias transgénicas antes da NT (Mitalipova et al., 2001; Merton et al., 2003; Rodriguez-Martinez 2012). Mais recentemente, foram utilizadas células estaminais pluripotentes induzidas em animais bovinos modificados com genes e aplicações de reprodução transgénica (Cao et al., 2012; Han et al., 2011; Dong et al., 2007).