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RESULTADOS

21 estudos de inalação de 21 dias comparando fumo normal e sidestream

O primeiro estudo do fumo sidestream no INBIFO, estudo 3047,13-16 foi um estudo de inalação de 21 dias iniciado em Novembro de 1981. Os ratos Sprague Dawley masculinos foram expostos a concentrações iguais (com base no total de partículas (TPM) por litro) de fumo de cigarros mainstream, fumo sidestream de um cigarro que foi fumado de acordo com o protocolo da Comissão Federal de Comércio (FTC),17 e fumo sidestream de um cigarro de combustão livre.14 Porque as partículas de fumo fresco de um cigarro sidestream têm um diâmetro aerodinâmico de 0,23 μM,18 as medições modernas de partículas PM2,5 e PM3,5 são equivalentes às medições de TPM utilizadas pela INBIFO.

A concentração de fumo era de 170 μg/l TPM (170 000 μg/m3), aproximadamente um terço da dose máxima tolerada determinada pelos estudos de inalação anteriores da INBIFO sobre o fumo normal.19,20 Vinte ratos em cada grupo de exposição foram expostos ao fumo sete horas por dia durante 21 dias. O método de exposição era “apenas cabeça”, o que significa que as ratazanas eram colocadas em primeiro lugar em tubos de plástico encaixáveis com uma porção de cabeça crivada que se projectava para uma conduta através da qual passava o ar fumado. Os controlos para a experiência consistiram em ratos mantidos nas suas jaulas normais (controlos de gaiola) e ratos que foram colocados em tubos de exposição mas que receberam ar fresco para respirar (exposição falsa).

Nenhum dos ratos de controlo morreu, um rato do grupo de exposição principal morreu, 11 ratos do grupo de sidestream inchado morreram ou foram mortos num estado moribundo, e 12 ratos do grupo de sidestream queimado livremente morreram ou foram mortos num estado moribundo14 (quadro 1). No final das exposições diárias, a temperatura média do corpo era de 37°C para ratos expostos à fraude e controlo de gaiolas, 36°C para os ratos expostos em geral, e 32°C para os ratos expostos à sidestream14 (quadro 1). O aumento da mortalidade indica que o fumo sidestream era mais agudamente tóxico e a queda na temperatura corporal sugere choque e função metabólica deprimida nas ratazanas expostas sidestream.21

A frequência respiratória dos grupos de controlo de fraudes e gaiolas foi de 107 respirações/min, ratos expostos 91 respirações/min, e ratos expostos sidestream 86 respirações/min.14 A farsa e os ratos de controlo de gaiola ganharam peso durante os 21 dias de exposição a aproximadamente 150% do seu peso corporal inicial; o grupo exposto principal atingiu 130% do seu peso corporal inicial; os grupos expostos lateralmente perderam peso, caindo para 80% do seu peso corporal inicial14 (quadro 1). A diminuição do peso corporal foi associada a diminuições no consumo de alimentos e sugere choque e caquexia.21

Após 21 dias de exposição, 6% dos ratos expostos ao mainstream mostraram ligeira atrofia do epitélio olfactivo, e 13% mostraram ligeira hiperplasia basal celular do epitélio ciliado na cavidade nasal. Todas as ratazanas expostas sidestream mostraram atrofia ou ulceração pronunciada do epitélio olfactivo e tanto a hiperplasia como a metaplasia de células escamosas do epitélio ciliado na cavidade nasal, com cornificação em alguns casos (quadro 1). Os investigadores concluíram: “A exposição sidestream induziu lesões epiteliais mais frequentes e mais graves no epitélio olfactivo e ciliado da cavidade nasal do que o epitélio normal”. Se se extrapolar a partir da experiência de estudos anteriores de inalação mainstream, a concentração total de material particular deste estudo teria de ser aumentada por um factor de três para produzir reacções fortes semelhantes às observadas com a exposição sidestream neste estudo “14

Um total de sete estudos de inalação de 21 dias comparando o fumo mainstream e sidestream foram realizados entre 1982 e 1985 (3057,35-37 3061,20,22-24 3069,25-29 3081,30-33 3108,38 311339,40). Quatro destes estudos (3057, 3061, 3069, 3081) utilizaram concentrações de fumo suficientes para matar 10% ou mais dos ratos (quadro 1). Perda de peso e temperatura rectal inferior a 33,5°C correlacionada com a mortalidade. Em média nos quatro estudos, o fumo sidestream causou taxas de mortalidade semelhantes a um terço da concentração (140 μg/l TPM) do fumo normal (469 μg/l).

Os técnicos que manipularam os animais também notaram outros sinais, mais subtis, da toxicidade comparativa do fumo do cigarro sidestream. O estudo 3061 comparou uma dose de 380 μg/l TPM mainstream com uma dose de 90 μg/l de sidestream. Os manipuladores de animais observaram: “todos os ratos tratados com fumo mostraram sinais gerais de exaustão após o fim da exposição diária. Ao contrário de todas as outras ratazanas que recuperaram até à manhã seguinte, as ratazanas do grupo mais elevado de sidestream continuaram a mostrar pêlo desgrenhado e uma ligeira diminuição da temperatura rectal”.24 Considerando estes factores em conjunto, os autores dos relatórios integradores dos estudos 3069 e 3081 afirmaram: “Os grupos expostos à sidestream mainstream e de dose elevada reagiram de forma aproximadamente semelhante, embora a concentração de TPM no grupo exposto à sidestream de dose elevada fosse aproximadamente um factor de quatro vezes inferior ao do grupo exposto à mainstream “25,41

Os resultados do exame histopatológico dos epitélios respiratórios apoiam a ideia de que o fumo sidestream é quatro vezes mais tóxico do que o fumo mainstream por grama. Comparada com base no TPM, a concentração de fumo sidestream suficiente para causar necrose do epitélio que reveste a cavidade nasal foi de 23% da do mainstream (quadro 1). A concentração de fumo sidestream suficiente para causar atrofia do epitélio olfactivo foi um décimo da do mainstream e a concentração de sidestream suficiente para causar metaplasia escamosa do epitélio nasal foi um terço (quadro 1).

Em Março de 1982, investigadores da INBIFO compararam os condensados de fumo mainstream e sidestream (recolhidos numa armadilha de impactação) num teste de mutagénese bacteriana (306742). Utilizaram o ensaio de incorporação de placas com microsomas S9 e duas estirpes de Salmonella typhimurium, TA 98 (que detecta as mutações frameshift), e TA 100 (que detecta a substituição do par de base de ADN). A estirpe TA 98 não mostrou diferença, mas a estirpe TA 100 mostrou uma actividade 30% mais elevada com condensado de sidestream. Estes resultados sugerem que o condensado de sidestream e os seus produtos de degradação metabólica induziram mais substituições de pares de bases por grama do que o condensado principal.

Tumourigénese

Em 1982, o condensado de fumo sidestream foi incluído numa experiência de 80 semanas de pintura da pele com tumourigénese em ratos (306843-45). Metade dos ratos recebeu um único pré-tratamento com 7,12 dimetilbenz(α)anthracene (DMBA), metade não recebeu. Os compostos químicos como o DMBA, que são suficientes para causar tumores por si mesmos, são chamados iniciadores de tumores. Os compostos químicos que não causam tumores por si só, mas que aumentam a incidência ou multiplicidade de tumores quando aplicados após um iniciador de tumores, são denominados promotores de tumores. As doses de condensado de fumo de cigarro aplicadas foram de 60, 90, ou 120 mg por rato por semana.

p>Sinais de intoxicação (actividade frenética, posição prona, ofegante, olhos fechados) foram mais pronunciadas entre os ratos tratados lateralmente e persistiram durante mais tempo. Apenas o condensado de sidestream causou mortalidade dependente da dosagem45 (tabela 2). Entre os ratos que não foram tratados com DMBA, a incidência de tumores foi 3,4-5 vezes maior nos ratos tratados com condensado sidestream do que nos ratos tratados com condensado mainstream (tabela 2), sugerindo que o condensado sidestream é um iniciador de tumores muito mais potente do que o condensado mainstream. Tendo em conta o tempo de desenvolvimento de tumores, a incidência de tumores e a multiplicidade de tumores, os investigadores da INBIFO concluíram que o condensado de sidestream, sem tratamento com DMBA, era 2-6 vezes mais tumourigénico do que o condensado principal e que o condensado de sidestream, precedido pelo tratamento com DMBA, era 2-3 vezes mais tumourigénico do que o condensado principal.43

Toxicidade aguda

O primeiro estudo de toxicidade aguda (307146),47) comparou aplicações únicas de condensado de fumo de cigarro mainstream e sidestream, variando de 100-2115 mg/kg de peso corporal, a ratos.48 Os ratos foram estudados durante duas semanas após a aplicação do condensado. A concentração de LD50 (concentração suficiente para causar a morte em 50% dos animais) para o condensado de sidestream foi de 608 mg/kg. Os animais pintados com condensado convencional não atingiram 50% de mortalidade durante o estudo, mas o LD50 extrapolado foi de 2370 mg/kg. O sidestream LD50 para exposição dérmica foi cerca de um terço do LD50.

p>Estudo 3099,47 um teste de toxicidade em células de cultura de tecido pulmonar humano, também demonstrou a diferença de toxicidade entre o fumo do mainstream e do sidestream. As células foram semeadas em monocamadas confluentes, autorizadas a fixar durante a noite, e expostas ao fumo fresco.49 O fumo foi bombeado para o espaço de ar selado acima das células pulmonares e do meio de cultura em concentrações variáveis e retido durante a noite, depois as células foram separadas dos frascos e testadas quanto à sua viabilidade na manhã seguinte. O LD50 para o fumo sidestream foi um terço do do fumo normal.49

Em 1984, a investigação sobre fumo de sidestream começou a passar dos efeitos toxicológicos agudos e tumourigénese para o teste dos seus efeitos em tipos celulares e sistemas celulares específicos, num esforço para determinar que componentes químicos tornavam o fumo de sidestream exclusivamente irritante, e para encontrar um nível de efeito não observável (NOEL) para inalação do fumo de sidestream.

Células brancas do sangue

Três estudos testaram o efeito da inalação de fumo nas populações de glóbulos brancos no pulmão (3108,38 3113,39,40 501550). A inalação do fumo de mainstream e sidestream não teve efeitos tão notoriamente diferentes sobre estas células como teve sobre o epitélio respiratório. Ambos os tipos de fumo aumentaram o número de leucócitos polimorfonucleares e macrófagos alveolares pulmonares recuperados dos pulmões,38 mas diminuíram o número total de leucócitos recuperados do sangue.39 Os linfócitos recuperados dos pulmões dos animais expostos ao mainstream tinham taxas ligeiramente mais elevadas de proliferação mitogénica do que os dos animais expostos ao sidestream.50 Os linfócitos recuperados dos animais expostos ao sidestream eram menos viáveis do que os dos animais expostos ao mainstream.38,50 Os resultados da redução da viabilidade linfocitária sugerem que a capacidade imunitária dos animais expostos ao fumo sidestream pode ser reduzida em relação à dos animais expostos ao fumo mainstream.51

Base química para o aumento da toxicidade sidestream

O primeiro estudo a examinar a base química para a diferença entre o fumo mainstream e o fumo sidestream em comparação com o fumo sidestream e o vapor de amoníaco numa experiência de inalação de um dia com ratos (310452-54). O fumo de sidestream contém entre 15-300 vezes mais amoníaco do que o fumo normal. A introdução ao relatório 3104 declara: “esperava-se que o amoníaco fosse um dos principais complementos irritantes do fumo de sidestream “52. Cinco concentrações de fumo de sidestream foram testadas, variando entre 13-253 μg/l TPM. As cinco concentrações de vapor de amoníaco testadas variaram de 51 μg/l (sobre o amoníaco em 253 μg/l TPM sidestream) a 414 μg/l (cerca de 10× o amoníaco em 253 μg/l TPM sidestream).

Doze dos 20 ratos expostos à mais alta concentração de sidestream morreram. Nenhum dos ratos dos grupos de amoníaco morreu.52 Durante as sete horas completas, a frequência respiratória dos ratos do grupo de sidestream com a dose mais elevada foi inferior a metade da dos controlos de falsificação. A frequência respiratória dos ratos do grupo de amoníaco da dose mais elevada igualou os controlos falsos.52 Nas concentrações mais elevadas de sidestream, a temperatura corporal dos ratos caiu de forma constante durante as sete horas de exposição, de 37°C para 30°C, mas a temperatura dos grupos de amoníaco não se alterou. Os cientistas da INBIFO concluíram que o fumo sidestream é 10 vezes mais irritante do que o vapor de amoníaco que contém.52

Estudo 506155 foi um seguimento para o estudo 3104. Testou os efeitos de cinco substâncias químicas encontradas em concentrações elevadas no fumo sidestream-formaldeído, acetaldeído, acroleína, amónia, e isopreno – numa exposição de três dias que mediu a quantidade de dióxido de carbono exalado pelos ratos.55 Alterações na quantidade de dióxido de carbono exalado indicam alterações tanto na frequência respiratória como no volume corrente. Diminuição da frequência respiratória e respiração pouco profunda são respostas à irritação sensorial.56 O estudo descobriu que a combinação dos cinco compostos, nas concentrações em que estão presentes no fumo sidestream, era apenas 10-20% tão irritante como o fumo sidestream total.55

O próximo estudo (312457-61) para examinar a base química da toxicidade do fumo sidestream comparando os efeitos do fumo sidestream inteiro, a fase de partículas do fumo sidestream, a fase de gás e vapor do fumo sidestream, e uma sidestream recombinada feita da fase de partículas e da fase de gás e vapor. Os ratos foram expostos aos diferentes fumos durante sete horas por dia, durante três dias. A respiração, sintomas de irritação, temperatura corporal, e peso corporal foram monitorizados, depois os ratos foram mortos e as suas vias respiratórias examinadas.

Fumo de sidestream total foi o mais irritante, seguido da fase de gás/vapor, da fase de fumo recombinado, e finalmente da fase de partículas.58 A fase de gás/vapor teve efeitos muito mais fortes no revestimento do epitélio das vias respiratórias do que a fase de partículas.60 A incidência de hiperplasia e metaplasia foi maior entre os animais expostos à fase de gás/vapor do que entre os animais expostos à fase de partículas.60 O único local dentro das vias respiratórias onde a fase de partículas causou mais danos do que a fase de gás/vapor foi a laringe anterior,60 possivelmente porque a laringe anterior é um importante local de impacto para as partículas inaladas no rato.62

Experimento 506263 comparou os efeitos no epitélio respiratório superior do fumo sidestream inteiro, fase de gás/vapor sidestream e uma mistura de formaldeído, acroleína, e amoníaco ao dobro da concentração a que estes compostos estão presentes no fumo sidestream inteiro. A mistura causou aproximadamente 35% dos danos causados pelo fumo de sidestream inteiro.63

Experiment 312664-66 comparado com o fumo de sidestream de cigarros 2R1 para sidestream de um cigarro sem tabaco, sidestream do cigarro sem tabaco com adição de nicotina, e aerossóis de nicotina pura, formaldeído, acetaldeído, acroleína, e amoníaco. As concentrações dos aerossóis de substâncias químicas únicas foram escaladas de modo a que a concentração mais elevada fosse aproximadamente o dobro da concentração desse componente no fumo 2R1.

Os pontos finais testados incluíram o ganho de peso, a exalação de dióxido de carbono (CO2), e a histopatologia do tracto respiratório. O fumo de 2R1 diminuiu mais o ganho de peso, seguido pelo cigarro sem tabaco com adição de nicotina, o cigarro sem tabaco, depois nicotina pura e acroleína.66 2R1 fumo e nicotina, nas suas concentrações mais elevadas, diminuíram a temperatura corporal em 5°C e 3,5°C, respectivamente.66 As concentrações médias e máximas de fumo 2R1 diminuíram a exalação de CO2 em aproximadamente 50%.66 A concentração mais elevada de nicotina pura diminuiu a exalação de CO2 em aproximadamente 20%.66 O aerossol de acroleína teve 20-25% do efeito do fumo 2R1 na histopatologia do epitélio respiratório.64 Na laringe, a concentração mais elevada de aerossol de acroleína causou quase tanto espessamento do epitélio como o fumo 2R1.64 Formaldeído, acetaldeído e amoníaco não tiveram efeitos. Em conjunto, estas experiências mostram que embora a acroleína e a nicotina possam ser responsáveis por alguns dos efeitos do fumo sidestream, todo o fumo é mais tóxico do que a soma dos efeitos dos seus principais componentes.

Nenhum nível de efeitos observáveis

Uma série de experiências iniciadas em 1985 que foi concebida para comparar diferentes métodos de exposição e encontrar NOEL para exposição a curto prazo (21-90 dias) de fumo sidestream fresco usando concentrações de 2-20 μg/l TPM e três métodos diferentes de exposição ao fumo. O método utilizado no estudo 311467,68 foi apenas a cabeça, o método padrão utilizado em todas as experiências anteriores. Os estudos 312569 e 312770 utilizaram uma exposição apenas ao nariz. Esta abordagem exigiu uma câmara de exposição mais restritiva e resultou numa maior tensão sobre os animais. Os ratos expostos à impostura, confinados em tubos de exposição apenas no nariz e com ar fresco para respirar, pesavam menos 20% do que os ratos de controlo da gaiola. O estudo 312334,71-73 utilizou uma exposição de todo o corpo. No sistema de exposição de todo o corpo, os animais foram expostos ao fumo enquanto estavam nas suas jaulas, movendo-se livremente em grupos de dois, em vez de estarem confinados sozinhos num tubo de exposição.

Estudo 311467,68 testou o fumo sidestream aos 3, 5, e 17 μg/l TPM. Os ratos foram divididos em dois grupos, um recebendo o fumo durante 3,5 horas/dia e o outro durante 7 horas/dia. Também testaram os efeitos de um período de recuperação de 14 dias após a exposição ao fumo. Com base nos resultados, os cientistas da INBIFO propuseram diferentes NOELs para cada sítio dentro do tracto respiratório superior: 2 μg/l para hiperplasia de reserva celular do epitélio na frente do nariz, 17 μg/l para cornificação do epitélio na frente do nariz e atrofia do epitélio olfactivo, e entre 2-17 μg/l para hiperplasia do epitélio das cordas vocais, dependendo do sítio exacto dentro das cordas vocais (quadro 3). (Estes níveis não são NOELs verdadeiros, uma vez que alguns efeitos ainda foram observados). Todas as alterações observadas no epitélio respiratório causadas por 21 dias de inalação foram reversíveis após 14 dias de recuperação.

Estudo 312334,71-73 mediu os efeitos de concentrações mais elevadas de fumo sidestream (20 e 60 μg/l TPM) utilizando um sistema de exposição corporal total. Os técnicos responsáveis pela manutenção da concentração de fumo nos níveis especificados recolheram amostras do fumo imediatamente antes de este ser libertado para as gaiolas e de dentro das gaiolas e repararam nisso: “As concentrações ‘reais’ nas gaiolas eram inferiores às determinadas na entrada pelo factor 0,8-0,9 para o TPM, 0,6 a 0,8 para a nicotina, 0,3 para o amoníaco, e 0,4 a 0,5 para o formaldeído. Com os outros componentes, o factor foi quase um “71 As concentrações mais baixas de alguns componentes do fumo reflectiram-se em danos menos graves para as vias respiratórias.72 Apesar das baixas concentrações de fumo e das câmaras de exposição não-restritivas, as ratazanas expostas ao fumo ainda apresentavam diminuições no ganho de peso de aproximadamente 15%71 (tabela 3).

Estudos 312569 (21 dias) e 312770 (90 dias) testados 2 μg/l e 6 μg/l TPM usando exposição apenas nasal. Nos 21 dias de exposição nenhuma das concentrações causou hiperplasia no epitélio nasal e a 6 μg/l concentração causou hiperplasia e ligeira metaplasia nas cordas vocais (quadro 3), bem como uma diminuição no ganho de peso de 12% para a baixa concentração e 24% para o grupo de alta concentração.74 No estudo de 90 dias ambas as dosagens causaram hiperplasia no epitélio nasal e nas cordas vocais70 (quadro 4), mas não houve efeito no ganho de peso. Em 6 μg/l TPM durante 90 dias houve uma metaplasia significativa nas cordas vocais. Os danos no epitélio respiratório em ambas as concentrações foram mais graves e mais prevalentes após 90 dias do que após 21 dias70 (quadro 4), o que demonstra que exposições mais longas ao fumo sidestream causam danos mais graves no tracto respiratório.