A clonagem do ADN pode ser realizada espontaneamente pela célula para fins reprodutivos. Esta é uma forma de reprodução assexuada em que um organismo se divide em fragmentos e depois cada um destes fragmentos se desenvolve em indivíduos maduros e completamente crescidos que são clones do organismo original (Ver fragmentação reprodutiva).A clonagem de ADN também pode ser realizada intencionalmente por investigadores de laboratório. Aqui, a fragmentação do ADN é uma técnica genética molecular que permite aos investigadores utilizar a tecnologia do ADN recombinante para preparar um grande número de moléculas de ADN idênticas.Para que a clonagem de ADN seja completada, é necessário obter discretas e pequenas regiões de ADN de um organismo que constituam genes específicos. Apenas moléculas relativamente pequenas de ADN podem ser clonadas em qualquer vector disponível. Portanto, as moléculas de ADN longas que compõem o genoma de um organismo devem ser clivadas em fragmentos que podem ser inseridos no ADN vectorial. Duas enzimas facilitam a produção de tais moléculas de ADN recombinantes:
1. Enzimas de RestriçãoAs enzimas de restrição são endonucleases produzidas por bactérias que normalmente reconhecem pequenas sequências de pares de bases (chamadas locais de restrição) e depois clivam ambas as vertentes de ADN neste local. Um local de restrição é tipicamente uma sequência palindrómica, o que significa que a sequência de local de restrição é a mesma em cada fita de ADN quando lida na direcção de 5′ a 3′. Para cada enzima de restrição, as bactérias também produzem uma enzima de modificação, de modo que o próprio ADN de uma bactéria hospedeira é protegido da clivagem. Isto é feito através da modificação do ADN hospedeiro em cada local de clivagem potencial ou próximo dele. A enzima de modificação adiciona um grupo metilo a uma ou duas bases, e a presença deste grupo metilo impede a libertação de endonuclease de restrição de cortar o ADN.
Muitas enzimas de restrição fazem cortes escalonados nos dois fios de ADN no seu local de reconhecimento, que gera fragmentos com uma única “cauda” encalhada que se sobrepõe em ambas as extremidades, chamada de ponta pegajosa. As enzimas de restrição também podem fazer cortes rectos nos dois fios de ADN no seu local de reconhecimento, o que gera pontas rombas. 2. Ligase de ADNDurante a replicação normal do ADN, a ligase de ADN catalisa a união (ligação) de ponta a ponta de fragmentos curtos de ADN, chamados fragmentos de Okazaki. Para efeitos de clonagem de ADN, a ligase de ADN purificada é utilizada para unir covalentemente as extremidades de um fragmento de restrição e de ADN vectorial que têm extremidades complementares. São covalentemente ligados entre si através das ligações padrão de 3′ a 5′ de fosfodiester de ADN. A ligase de ADN pode ligar as extremidades complementares pegajosas e rombas, mas a ligadura de extremidades rombas é ineficiente e requer uma concentração mais elevada de ADN e ligase de ADN do que a ligadura de extremidades pegajosas. Por esta razão, a maioria das enzimas de restrição utilizadas na clonagem de ADN fazem cortes escalonados nas cordas de ADN para criar pontas pegajosas.
A chave para clonar um fragmento de ADN é ligá-lo a uma molécula de ADN vectorial que se pode replicar dentro de uma célula hospedeira. Depois de uma única molécula de ADN recombinante (composta de um vector mais um fragmento de ADN inserido) ser introduzida numa célula hospedeira, o ADN inserido pode ser replicado juntamente com o vector, gerando um grande número de moléculas de ADN idênticas.O esquema básico para isto pode ser resumido da seguinte forma:
Vector + ADN Fragment↓ Recombinante DNA↓ Replicação do ADN recombinante no hospedeiro cell↓ Isolamento, sequenciação, e manipulação do fragmento de ADN purificado
Existem numerosas variações experimentais a este esquema, mas estas etapas são essenciais para a clonagem do ADN num laboratório.