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Um Microscópio Confocal é um tipo de Microscópio de Fluorescência 3D em que a resolução é aumentada através da rejeição de luz desfocada. Isto é feito utilizando pinholes com um Raio Pinhole específico e torna-o um microscópio 3D intrínseco: devido à natureza de focalização do microscópio confocal, é especialmente adequado para obter imagens 3D como uma colecção de intensidades em diferentes pontos do espaço.
As imagens confocais são muito adequadas para a deconvolução Huygens, com a Opção Óptica Confocal Huygens, devido a duas razões principais:
1. ainda sofrem de desfocagem, que pode ser claramente vista ao gravar imagens de esferas
2. em geral, as imagens confocais são mais ruidosas do que as imagens de campo largo, porque a luz do objecto é rejeitada pelo orifício.
Nos microscópios confocais, a Taxa Nyquist é cerca de metade da dos microscópios de campo largo.

Como funciona um microscópio confocal

Os sistemas biológicos são tipicamente estruturas tridimensionais. Quando a amostra rotulada com fluoróforo é inundada com luz laser de excitação, como na microscopia convencional de campo largo, a imagem resultante é normalmente muito perturbada por luz fluorescente desfocada. Isto leva a uma desfocagem da imagem e resulta numa diminuição significativa do contraste. A microscopia confocal é uma técnica para reduzir esta luz fora de foco indesejada. Nesta técnica, a luz de excitação é fortemente focada na amostra. A luz de emissão do foco é recolhida pelo mesmo objectivo, após o qual é focada através de um pequeno orifício e direccionada para um fotodetector (Figura 1 (a)). A luz de emissão fora de foco será em grande parte bloqueada pelo orifício (Figura 1 (b)). O resultado deste método é que apenas a luz do volume focal é capaz de alcançar o detector. A desvantagem é que também a luz de outros locais no plano focal é bloqueada: a microscopia confocal é a excitação pontual e a detecção pontual. Uma solução é varrer em varrimento da amostra ponto a ponto para reconstruir uma imagem completa na qual apenas o sinal fluorescente do plano focal é recolhido. Esta digitalização raster pode ser repetida para diferentes planos focais para seccionar amostras espessas e reconstruir uma imagem 3D da amostra.
Alternativamente, também é possível digitalizar a amostra com múltiplos pontos de excitação em paralelo, tal como com um microscópio Spinning Disk.
STED é praticamente uma extensão da microscopia confocal de varrimento ponto a ponto. O feixe STED precisa de ser focalizado na amostra para obter a alta intensidade necessária para a emissão estimulada, enquanto a detecção pontual reduz a luz desfocada. Para que o STED funcione, o centro de foco de excitação e a intensidade STED nula do foco em forma de donut precisam de se sobrepor perfeitamente. Uma imagem pode então ser obtida por varrimento raster da amostra, por exemplo com uma fase de varrimento piezo. O tamanho do orifício utilizado determinará a profundidade de focagem do microscópio.

Figure 1. Ilustração do princípio do microscópio confocal. Um feixe colimado de luz de excitação (azul) é firmemente focado na amostra por uma objectiva de microscópio. A imagem da esquerda mostra que a luz de emissão resultante do ponto focal será focada através do orifício e a maior parte da luz alcançará o detector. O lado direito mostra o caso em que a luz emitida surge de um ponto que se encontra fora do volume focal. Esta luz não será focada através do orifício e apenas uma quantidade muito pequena de luz é capaz de alcançar o detector. Como resultado, a luz fluorescente fora de foco é principalmente bloqueada pelo orifício e, portanto, o sinal de fundo é significativamente reduzido.

h2>Imagens confocais em rotaçãoA aplicação da desconvolução em imagens confocais aumenta a sua resolução em x, y e z e restabelece a sua resolução a partir do ruído. Portanto, as imagens serão mais fáceis de visualizar e analisar. O algoritmo por defeito para Confocal é a Estimativa de Máxima Probabilidade Clássica (CMLE) e o valor de SNR por defeito é 20. Sugerimos começar com os parâmetros por defeito e explorar outros valores SNR, por exemplo, para optimizar os resultados da desconvolução. Não se deve pensar no SNR como um parâmetro que descreve a sua imagem original, mas como um parâmetro sintonizável que controla o resultado desconvolutivo. Utilizar um valor de SNR demasiado grande pode ser arriscado ao restaurar originais ruidosos, porque pode estar apenas a aumentar o ruído. Uma imagem confocal ruidosa pode ter valores de SNR inferiores a 20. Outra opção é testar o algoritmo de Estimativa da Probabilidade Máxima (GMLE) do Bem para melhorar os resultados. O GMLE é adequado para imagens ruidosas, como confocal ou STED.
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Remko R.M. Dijkstra, Design e realização de uma configuração de microscópio de super-resolução CW-STED, Tese de Mestrado , Universidade de Twente, 2012