Este estudo baseia-se num sistema de membrana que era caro a K. R. Porter: o retículo sarcoplasmático (SR) das fibras musculares estriadas. Porter baptizou adequadamente o sistema de membrana abundante que envolve de perto e completamente as miofibrilas em todas as células musculares como o SR, com base na sua localização (sarcoplasmático) e estrutura geral como uma extensa rede (retículo). Nas suas descrições do SR, iniciadas em colaboração com H. S. Bennett (1-3), Porter reconheceu dois aspectos importantes deste sistema de membranas. O primeiro é que o SR é simplesmente uma expressão especializada do retículo endoplasmático (RE) que permeia todos os tipos de células, e o segundo é que a disposição precisa do SR em relação às miofibrilas indica o seu papel em algum aspecto do controlo da contractilidade. Ambas as percepções de Porter estão agora plenamente confirmadas. Sabe-se que o SR se desenvolve inicialmente como ER contendo as habituais proteínas ER genéricas da variedade de jardim e que, à medida que a célula muscular se diferencia, torna-se grandemente enriquecida em proteínas específicas do SR (4, 5). Três proteínas primeiro purificadas do SR são a ATPase de cálcio ou proteína da bomba de cálcio responsável por bombear cálcio para a luz do SR durante o relaxamento (6); a calsequestrina, a proteína de baixa afinidade de ligação ao cálcio que aumenta grandemente a capacidade de luz do SR para o cálcio (7); e o receptor de ryanodina (RyR), responsável pela libertação de cálcio durante a activação muscular (ver ref. 8 para uma revisão). Verificou-se mais tarde que todos os tipos de células contêm formas específicas de células e/ou análogas destas três proteínas responsáveis pelo manuseamento do cálcio. Em todas as células, estas proteínas tendem a ser agrupadas. O SR é assim um domínio extenso e especializado da célula muscular ER. Inversamente, todas as células contêm domínios especializados semelhantes aos do SR, mas em quantidades muito menores. Algumas células não musculares, tais como as células Purkinje do cerebelo, têm na realidade extensos domínios semelhantes ao SR contendo isoformas musculares específicas de RyRs e calsequestrina (9, 10).
Como Porter, no seu estilo inimitável, escreveu: específica “a relação morfológica precisa do retículo com as miofibrilas…. leva a sugerir que o sistema é funcionalmente importante na contracção muscular”. A compreensão do papel específico do SR no controlo da contracção muscular foi moldada por publicações críticas no período excitante que imediatamente precedeu e seguiu as descrições de Porter do SR. As experiências de estimulação local de A. F. Huxley, realizadas no final dos anos cinquenta e início dos anos sessenta, indicaram a presença de uma via específica que permitia a propagação do evento eléctrico para o interior da fibra e, assim, proporcionava uma ligação crucial entre a despolarização da superfície e a rápida activação das miofibrilas localizadas centralmente (ver ref. 11 para uma revisão). O artigo seminal de 1959 de A. Weber deu a primeira prova de que os iões de cálcio, agora totalmente reconhecidos como mensageiros intracelulares gerais, são responsáveis pelo controlo da contracção muscular (12). S. Ebashi e A. Weber influenciaram-se mutuamente através dos continentes na construção de provas claras de que a capacidade de sequestro de cálcio do SR é totalmente responsável pelo relaxamento, enquanto que W. Hasselbach definiu com precisão a acção de bombeamento de cálcio do SR (ver ref. 13 para uma revisão).
Having followed closely followed L. D. Peachey in Porter’s laboratory, eu estava plenamente consciente da procura, iniciada pelos resultados de A. F. Huxely, de uma ligação entre o plasmalemma da fibra muscular e o seu interior que permitisse a rápida propagação do evento eléctrico para o interior da fibra (14). No seu artigo de 1957 (3), Porter e Palade tinham descrito uma unidade estrutural repetitiva, a tríade, que se situa em relação precisa com as bandas das miofibrilas: ou oposta à linha Z ou oposta à junção A-I. A tríade é composta por 2 cisternas SR, intimamente viradas para um túbulo central. A localização da tríade (3) e do seu túbulo central (15-17) coincide com os locais em que ocorre a propagação interior das contracções resultantes da despolarização local (11). Usando cuidadosas secções em série, Andersson-Cedergren (18) demonstrou que os elementos centrais da tríade formam uma rede contínua através das fibras musculares, daí o nome túbulos transversais (T) para estes componentes da tríade. Assim, os olhos dos microscopistas electrónicos concentraram-se nos túbulos T, e eu fui preparado para a descoberta que me cumprimentou no final do meu período de pós-doutoramento no laboratório de Porter (1963). Estava a observar secções finas do músculo esquelético dos guppies que tinham sido criados nos tanques de Elisabeth Porter e de repente vi repetidos exemplos de bocas largas de túbulos T na borda da fibra. Foi fácil conseguir a atenção de Porter: Entrei no seu laboratório às 10:00-11:00, o fim habitual do seu dia de trabalho, quando ele podia relaxar, e mostrei-lhe os meus negativos. O interesse de Porter foi imediatamente despertado. As minhas fotografias não estavam de acordo com os seus elevados padrões, por isso ele levou um dos meus blocos, cortou pessoalmente secções finas, e levou uma série de micrografos, cada um deles uma obra de arte (Fig. 1A). Os micrografos de Porter constituíram a maioria das ilustrações na publicação final, mostrando que os túbulos T têm as características essenciais necessárias para o seu papel na despolarização da membrana superficial no interior da fibra (19, ver também Fig. 1B). A continuidade do lúmen dos túbulos T com os espaços extracelulares foi também confirmada no mesmo ano pela penetração de traçadores de espaço extracelular (20, 21) e de um corante fluorescente (22). A continuidade dos túbulos T com a membrana superficial está na base da grande capacitância da membrana superficial das fibras musculares.
domínios funcionais do SR estão associados quer à membrana superficial quer aos túbulos T (Figs. 1C, G), formando junções bem definidas com eles chamadas unidades de libertação de cálcio (ver 23, 24 para revisões). Durante o acoplamento excitação-contracção (e-c), as membranas exteriores são inicialmente despolarizadas, e imediatamente após o SR liberta cálcio para os espaços miofibrilares. A questão estrutural torna-se então: qual é a relação entre o SR e as membranas exteriores nestes sítios juncionais especializados que permite a tradução do evento eléctrico em libertação de cálcio do SR durante a activação muscular? Saltando no tempo por ∼25 anos, a questão estrutural moderna relativa a esta etapa do acoplamento e-c é: qual é a relação espacial entre as proteínas do SR e das membranas exteriores nas unidades de libertação de cálcio, e o que se pode deduzir desta associação? Quatro proteínas do SR juncional estão bem identificadas: os receptores de ryanodine (RyRs), ou canais de libertação de cálcio do SR (8); calsequestrina (7, 25); triadina (26); e junctina (27). Os RyRs são canais de cálcio homotetramericanos constituídos por 4 subunidades idênticas com um grande domínio citoplasmático e uma massa combinada de ∼2,000 kDa, que, quando abertos, permitem uma fuga rápida do cálcio SR para os espaços miofibrilares. Os domínios citoplasmáticos dos RyRs são visíveis no microscópio electrónico como pés que ligam a superfície do SR juncional às membranas exteriores (Fig. 1C, D). Os RyRs estão assim estrategicamente localizados para interagir com a membrana da superfície. A calsequestrina é uma proteína luminal da cisterna do SR, localizada na proximidade dos domínios juncionais do SR (Figs. 1B, C). A sua função é aumentar a capacidade total de cálcio do lúmen do SR, mantendo uma concentração relativamente alta de cálcio livre, permitindo assim um grande gradiente na concentração de cálcio iónico entre o lúmen do SR e as miofibrilas. A triadina é provavelmente a proteína que liga a calsequestrina à superfície do SR, mantendo-a na proximidade dos RyRs, e a junctina pode também ter um papel semelhante. Uma das duas últimas proteínas, ou outras ainda por identificar, é responsável por manter a calsequestrina imobilizada na proximidade dos canais de libertação de cálcio. Uma proteína de membrana superficial está localizada nos domínios juncionais das membranas externas que participam nas unidades de libertação de cálcio (23): o canal de cálcio do tipo L, também chamado receptor de dihidropiridina (DHPR). Os DHPRs actuam como sensores de tensão, bem como canais de cálcio, e a sua acção é necessária para iniciar a libertação de cálcio do SR (28, 29).
No músculo esquelético, os DHPRs são agrupados em tetrads, ou grupos de 4 componentes localizados nos cantos de pequenos quadrados (Figs. 1E, I). Os tetrads de DHPRs formam conjuntos ordenados de tetrads que enfrentam conjuntos ordenados dos pés SR de tal forma que cada um dos 4 DHPRs que compõem o tetrad parece estar ligado a uma subunidade de um pé subjacente (30, 31). Esta relação estrutural directa das 2 principais proteínas da unidade de libertação de cálcio ajuda a suportar a chamada hipótese ‘mecânica’ de acoplamento e-c, propondo que os sensores de tensão na membrana do túbulo T (mais tarde mostrados como sendo os DHPRs) detectem a despolarização e afectem a libertação de cálcio do SR através de uma interacção molecular directa (32). Uma das observações estruturais intrigantes relativamente à relação DHPR-RyR é que os tetrads estão associados a pés alternativos (Fig. 1 M), deixando um conjunto de pés órfãos (ou RyRs) que não estão directamente ligados aos DHPRs. O trabalho comparativo sobre uma variedade de músculos in vivo e in vitro indica que a disposição alternativa é a regra para o músculo esquelético, e não depende da presença de 2 tipos de isoformas de RyR.
Recente exploração da base molecular e de desenvolvimento da relação DHPR-RyR é o trabalho de dois colegas pós-doutorados no meu laboratório (Drs. Hiroaki Takekura e Feliciano Protasi) e envolve colaborações com os Drs. P. D. Allen, K. G. Beam, B. E. Flucher, e H. Takeshima. A primeira questão que consideramos é como a disposição alternativa dos tetrads é produzida durante o desenvolvimento das junções. Esta questão foi explorada em colaboração com o Dr. B. E. Flucher, utilizando células de origem muscular esquelética na linha celular BC3H1, que desenvolvem clusters co-localizados de DHPRs, triadina e RyRs na periferia celular (33). As secções finas e a fractura por congelação destas células mostram unidades de libertação de cálcio bem diferenciadas, contendo extensos conjuntos ordenados de pés e tetrads. As tetrads têm uma disposição alternativa. Muitas das junções têm tetrads com elementos em falta, e como as encontramos tanto nos primeiros como nos últimos dias da cultura, assumimos que muitas representam junções no processo de formação. Curiosamente, mesmo quando bastante incompletas, as matrizes de tetrads têm a disposição alternativa em relação às matrizes de pés, indicando que esta relação é intrínseca às interacções entre as 2 proteínas.
A segunda questão é se o agrupamento de DHPRs em tetrads é exclusivo do músculo esquelético ou está presente em músculos que parecem ter uma base diferente para o acoplamento e-c. O músculo cardíaco contém isoformas de RyRs e DHPRs diferentes das do músculo esquelético, e diferem funcionalmente na medida em que a permeação do cálcio através dos DHPRs parece ser um requisito para o acoplamento e-c (34, 35). Os DHPRs e os RyRs do músculo cardíaco estão localizados em locais que parecem co-localizados ao nível do microscópio luminoso (Fig. 1F), tal como no músculo esquelético, e esta justaposição é alcançada precocemente na diferenciação do aparelho de acoplamento do e-c (36-38). A fractura por congelação, contudo, mostra que a disposição de DHPRs no músculo cardíaco é distinta da do músculo esquelético (comparar Figs. 1I, K). Os DHPRs estão na proximidade dos pés mas não parecem estar directamente ligados a eles (Fig. 1N) para que a sua interacção possa ser indirecta, através de um transmissor (por exemplo, o cálcio).
A informação acima é directamente relevante para a compreensão de 2 modelos de rato para o estudo do acoplamento e-c. Num modelo, falta a subunidade principal (α1) do esqueleto DHPRs. Os músculos não se contraem devido à falta de acoplamento e-c e desenvolvem-se de forma deficiente (daí o termo disgénico). No entanto, são formadas tríades contendo conjuntos de pés, indicando que a presença de RyRs não é necessária para a formação de junções de superfície SR. Os aglomerados de DH-PRs (detectados por imuno-rotulagem) e de DHPR tetrads (detectados por fratura gelada) faltam nas células musculares disgénicas, mas são restaurados por transfecção de miotrubos disgénicos cultivados com cDNA para DHPR, demonstrando que as tetrads são compostas de DHPRs (31, 39, 40). O outro modelo é uma mutação nula visada do tipo esquelético RyR, que também resulta num bloco de acoplamento e-c. As fibras musculares sem RyR, inesperadamente, formam tríades (41) (Fig. 1H). As tríades não têm pés, daí o termo tímpido, mas de resto parecem normais em secções finas. Uma linha celular (1B5) desenvolvida a partir de uma mutação disfédica também carece de acoplamento e-c. Utilizando estas células, mostrámos que apesar da ausência de pés, as junções tímpidas de superfície SR são formadas e contêm triadina e DH-PRs (42). No entanto, na fratura gelada, os aglomerados de DHPRs localizados nas junções dyspedic não se agregam em tetrads (Fig. 1L). A expressão da codificação do cDNA para o músculo esquelético tipo 1 RyR em células 1B5 resulta na formação de pontos RyR periféricos (Fig. 1P) e no agrupamento de DHPR em tetrads (Fig. 1Q). Assim, os DHPRs não precisam da presença de RyRs para se aglomerarem em sítios juncionais de superfície SR, mas precisam de uma interacção com RyRs esqueléticos para formar tetrads. Isto também confirma indirectamente que existe uma ligação entre RyR e DHPRs nas fibras musculares esqueléticas. Pelo contrário, a falta de tetrads no músculo cardíaco indica que ou uma ligação RyR-DHPR não está presente ou que a ligação é diferente da que existe no músculo esquelético. Tanto a presença da ligação RyR-DHPR como a sua ausência ou diferença têm profundas implicações funcionais no acoplamento e-c. K. R. Porter teria aprovado estes desenvolvimentos na nossa compreensão do SR, porque se baseiam em relações estrutura-função precisamente definíveis.