2.1. Propriedades de crescimento de S. boulardii
Para caracterizar ainda mais esta levedura, as suas propriedades de crescimento a diferentes temperaturas são comparadas com outras estirpes de levedura diplóide (todas as estirpes de levedura utilizadas estão resumidas no Quadro 1). S. boulardii (manterei este nome no texto mesmo sendo uma estirpe de S. cerevisiae) cresce bem em meio rico a 30°C bem como a 37°C mas não a 40°C (Figura 1A). O crescimento a 37°C – embora não seja ideal – não é invulgar às estirpes de levedura como a estirpe diplóide BY4743 (uma derivada de S288C) mas ao contrário da estirpe diplóide RH2585/2586 (uma derivada de Σ1278b) que quase não cresce a 37°C (Figura 1A). Nesse sentido, o crescimento a 37°C não é uma propriedade particular e única de S. boulardii. Provavelmente reflecte antes o seu alojamento a climas quentes como os que se encontram frequentemente na Indochina.
| Nome e propriedades da estirpe de levedura diplóide | Auxotrophic properties/antibiotic resistances |
|---|---|
| BY4743 | Requer histidina, leucina, metionina, e uracil |
| RH2585/2586 | Requer histidina e uracil |
| RH2585/2586 ∆flo8::kanX ∆flo8::NATR | Sem requisitos; G418- e NAT-resistente |
| S. boulardii | Nenhum |
| Sem requisitos; G418- e resistente a NAT | |
| S. boulardii ∆rem1::kanX ∆rem1::NATR | Sem requisitos; G418- e resistente a NAT |
| S. boulardii ∆his3::kanX ∆his3::NATR | Requer histidina; G418- e resistente a NAT |
| S. boulardii ∆ade2::kanX ∆ade2::NATR | Requer adenine; G418- e resistente a NAT |
Tabela 1.
estirpes de levedura diplóide utilizadas neste trabalho.
G418/geneticina e NAT/nourseothricin são antibióticos selectivos para estirpes de levedura.
Figure 1.
Propriedades de S. boulardii e outras estirpes de levedura diplóide (todas listadas na Tabela 1). (A) Comparação do crescimento de cepas de levedura a diferentes temperaturas. As estirpes de levedura indicadas foram espalhadas em placas de YPD e incubadas a temperaturas indicadas (30, 37, e 40°C) durante 2 dias; (B) propriedades de filamentação de diferentes estirpes de levedura. As estirpes RH2585/2586, RH2585/2586 ∆flo8::kanX ∆flo8::NATR, e S. boulardii foram incubadas em placas SLAD (50 μM sulfato de amónio) durante 1 dia a 30°C e colónia de crescimento individual visualizada sob o microscópio (painel superior: 20× aumento; painel inferior: 100× aumento); (C) crescimento de S. boulardii em diferentes meios. S. boulardii (#1785) e derivados ∆∆his3 (#1811) e ∆∆ade2 (#1812) foram cultivados durante 2 dias a 30°C em meio mínimo SD (placa esquerda) ou em YPD + G418 e nourseothricin (ambos na placa final 100 μg/ml) (placa direita). Denota a cor rosada característica da estirpe #1812 devido à eliminação de ambas as cópias do gene ADE2.
Uma propriedade mais investigada é a potencial capacidade de S. boulardii de formar filamentos. Para este fim, foi cultivada em placas SLAD que transportam apenas concentrações limitadas de sulfato de amónio (50 μM, cerca de 1000× menos do que o meio mínimo convencional SD). Como observado sob o microscópio, a estirpe diplóide RH2585/2586 mostra claramente propriedades filamentosas sob tais condições de limitação de amónio (Figura 1B) . A eliminação do gene FLO8 que codifica um factor transcripcional necessário para a filamentação e adesão aboliu completamente as suas propriedades filamentosas. Flo8 é necessário para expressar, por exemplo, Flo11, uma glicoproteína de superfície celular . Ao contrário do RH2585/2586, S. boulardii quase não mostrou quaisquer propriedades de filamentação. Curiosamente, o sequenciamento do gene FLO8 amplificado por PCR de S. boulardii indicou que este não carrega um códão de paragem prematura (não mostrado) encontrado em estirpes de levedura não filamentosas como as derivadas de S288C . Assim, outros genes a montante ou a jusante necessários para a filamentação são provavelmente disfuncionais em S. boulardii. A sua falta de filamentação explica provavelmente a sua baixa toxicidade e a sua falta de capacidade de estabelecimento no tracto gastrointestinal que, de outra forma, poderia torná-lo mais persistente e, portanto, mais problemático para aplicações médicas.
Outra questão interessante foi a de induzir a meiose e a esporulação em S. boulardii a fim de obter uma descendência haplóide. Para este efeito, as células diplóides foram incubadas num meio líquido com concentração limitada de azoto e acetato de potássio muito elevada como fonte (pobre) de carbono. Apesar de várias tentativas, não foi observada qualquer formação de tetrad. A esse respeito, S. boulardii mostra propriedades semelhantes às da RH2585/2586 (a diploide filamentosa utilizada neste trabalho) que não forma tetrads no tratamento nas condições descritas. A fim de induzir a meiose e a esporulação, foi produzido um duplo knockout de RME1 (Regulador da Meiose 1) em S. boulardii. RME1 é um regulador negativo de meiose que impede a expressão de proteínas requeridas pela meiose, tais como IME1 (Indutor de Meiose 1) e promove a mitose . O derivado de S. boulardii ∆∆rme1 não mostrou quaisquer diferenças fenotípicas em relação à estirpe do tipo selvagem parental em termos de temperatura de crescimento (Figura 1A). Infelizmente, também não foram obtidos tétrades desta estirpe nocturna. Concluo que S. boulardii não sofre de meiose e formação de tetrad haplóide pelo menos em condições laboratoriais aqui utilizadas.
Como mostrado na Figura 1C, S. boulardii não carrega quaisquer marcadores auxotróficos uma vez que cresce bem em meio mínimo (SD) desprovido de aminoácidos ou componentes de ácido nucleico tais como adenina ou uracil. Os genes marcadores auxotróficos poderiam ser facilmente obtidos através da eliminação dos genes ADE2 (biossíntese de adenina) ou HIS3 (biossíntese de histidina) (Figura 1C). Estas supressões foram obtidas pela introdução de genes marcadores auxotróficos dominantes que fornecem resistência aos antibióticos canamicina/G418 ou nourseothricina. A eliminação de uma única cópia do gene ADE2 ou HIS3 ainda permitia o crescimento em placas médias mínimas (não mostradas), indicando o claro carácter diplóide desta levedura. Apenas a dupla eliminação de ambas as cópias de HIS3 ou ADE2-gene (que a tornou resistente tanto à canamicina/G418 como à nourseothricina; Figura 1C) tornou esta levedura auxotrofia da estirpe auxiliar para a histidina ou para a adenina. A auxotrofia da histidina recentemente adquirida foi utilizada numa experiência subsequente para a transformar com plasmídeos de levedura portadores de HIS3 como um gene marcador seleccionável (ver texto subsequente).