Abstract
Muitos pacientes experimentam excelentes recuperações físicas após a cirurgia; contudo, há alguns que sofrem de flutuação de humor, mesmo depressão. A depressão pós-operatória pode ser resultado de disfunção cognitiva, dor, e um sistema imunitário comprometido durante a cirurgia. Mas existe uma maior possibilidade de que a anestesia geral possa ser responsável pelo desenvolvimento da depressão. Aqui, utilizámos um dos anestésicos mais utilizados, o propofol, num modelo de rato para investigar se este composto anestésico intravenoso poderia causar um desempenho comportamental depressivo em ratos. Encontrámos uma única dose de propofol que causou um comportamento anormal significativo em suspensão da cauda, natação forçada, e testes em campo aberto. Também examinámos a secção cerebral destes ratos e revelámos que havia uma redução significativa da expressão da proteína CD11b, que demonstrou uma inibição do propofol na função microglial. Investigámos o efeito do propofol na proteína sináptica, SYP, e descobrimos que não havia influência notável na expressão da proteína. Estes resultados acima sugeriram que o tratamento com propofol poderia promover os comportamentos depressivos em ratos através da influência na função da célula microglial. Além disso, descobrimos que o nível da citocina IL-6 estava significativamente aumentado no tecido cerebral, o que poderia subsequentemente causar a activação do factor transcripcional, STAT3. A nossa descoberta pode fornecer uma nova perspectiva de maior compreensão do mecanismo das drogas anestésicas e decifrar o mecanismo subjacente da depressão pós-operatória.
1. Introdução
Muitos pacientes que se submetem a anestesia geral ou cirurgia experimentam alguma forma de depressão pós-cirúrgica, especialmente durante os seis meses que se seguem a um procedimento invasivo . Como uma das complicações frequentes após a cirurgia, a depressão pode levar a uma maior morbilidade e mortalidade, especialmente para os pacientes idosos . Entretanto, os investigadores descobriram que os pacientes deprimidos são mais propensos a ter outras complicações após a cirurgia . São menos capazes de cooperar bem com os cuidadores nos seus cuidados pós-cirúrgicos, tais como terapia reabilitativa. Em pacientes que já têm um historial de depressão ou ansiedade pré-existente, o tempo de recuperação da depressão pós-cirúrgica é muito maior . Um estudo também sugeriu que a cirurgia poderia exacerbar a gravidade da depressão pré-existente . Até agora, pouco se sabe sobre o porquê de existir uma ligação tão forte entre a cirurgia e a depressão. Alguns investigadores pensaram que a razão psicológica per se é que muitas pessoas sofrem de depressão pós-cirúrgica porque os procedimentos cirúrgicos forçam-nas a confrontar a sua própria mortalidade. Alguns estudos também enfatizaram os tipos específicos de cirurgia per se na indução da depressão pós-cirúrgica, uma vez que a depressão parece ser mais frequentemente observada em algumas cirurgias importantes, incluindo a cirurgia do cérebro, a cirurgia de substituição da anca, e a ressecção do cancro. No entanto, estudos recentes sugeriram que o tempo passado sob anestesia parecia estar relacionado com a probabilidade e gravidade da depressão. O Propofol é um dos anestésicos mais utilizados no contexto dos cuidados intensivos após a cirurgia. Verificou-se que o tratamento com Propofol está significativamente associado a disfunções cognitivas no período pós-operatório . Não se faz qualquer esforço para examinar se e como o propofol pode ter impacto no estado de espírito dos pacientes e dos animais até à data. Por conseguinte, utilizámos um modelo de rato com uma única dose de tratamento com propofol e testámos os comportamentos depressivos no modelo de rato. Encontrámos ratos expostos a uma única dose de tratamento com propofol que exerciam comportamentos semelhantes à ansiedade num teste de campo aberto, mostrando menos tempo na área central e comportamentos semelhantes à depressão na suspensão da cauda e testes de natação forçada, mostrando um tempo de imobilidade mais longo do que os ratos de controlo sem injecção de propofol. Os nossos resultados indicaram que o propofol pode ser responsável pela flutuação de humor após a cirurgia e este efeito pode estar associado à influência do propofol nas células da microglia no sistema nervoso central (SNC).
2. Materiais e Métodos
2.1. Tratamento de Animais e Drogas
No presente estudo, utilizámos ratos C57BL/6 machos com 8-10 semanas de idade. Todos os ratos tinham livre acesso a água e alimentos. Para todos os estudos com animais aqui, os ratos foram tratados seguindo estritamente as directrizes estabelecidas pelo Conselho Chinês de Cuidados com Animais. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comité de Cuidados de Animais do Hospital Municipal de Qingdao, Shandong, China. Havia dois grupos de ratos no estudo: salino normal (controlos; ) e propofol (75 mg/kg; ). Uma dose única de propofol foi administrada aos ratos por via intraperitoneal. A solução comercial de injecção de propofol (Xi’an Libang Pharmaceuticals, China) foi utilizada aqui. A dose de propofol utilizada aqui é adaptada do estudo anterior. Durante o tempo de anestesia, todos os ratos foram colocados na almofada de aquecimento para manter a sua temperatura corporal. Os testes comportamentais foram realizados 1 semana depois.
2.2. Campo aberto
Uma caixa de madeira quadrada foi utilizada aqui para o teste de campo aberto, como descrito anteriormente . No início do teste, cada rato foi colocado num canto da caixa de frente para a parede. A distância total percorrida e o tempo total gasto nos quadrados interiores de todos os ratos foram registados e medidos numa sessão de 5 minutos.
2,3. Teste de suspensão da cauda
Para o teste de suspensão da cauda, os procedimentos foram realizados como previamente relatado . Os ratos foram suspensos através de caudas com uma fita adesiva num pequeno gancho de metal, e não podem escapar ou agarrar-se a superfícies próximas nesta posição. Foi registado o tempo total de imobilização dos ratos durante o período de teste de 6 minutos. A imobilidade é definida como a falta de tentativa dos ratos de moverem os seus corpos.
2,4. Teste de natação forçada
Realizámos o teste de natação forçada, tal como anteriormente relatado. Os ratos foram colocados num copo de vidro cheio de água à temperatura ambiente. Testamos o tempo total de imobilidade dos ratos numa sessão de teste de 15 min, e os últimos 6 min foram pontuados pela duração da imobilidade. No final de cada teste, os ratos molhados foram imediatamente colocados numa gaiola com roupa de cama normal após terem sido aquecidos numa toalha seca.
h5>2,5. Elevated Plus Maze Test
O labirinto elevado mais é um método simples para avaliar as respostas de ansiedade animal. Testamos o nível de ansiedade de ratos utilizando o ensaio Elevado Mais Labirinto, como anteriormente relatado. Basicamente, o aparelho elevated plus labirinto está equipado com dois braços abertos e dois fechados e elevado a uma altura de cerca de 50 cm acima do solo. No início de cada teste, o rato foi colocado no quadrado central, de frente para o braço aberto e depois foi-lhe permitido explorar os braços durante 5 min. O tempo gasto nos braços abertos foi registado e analisado por uma pessoa que não estava envolvida no desenho experimental.
h5>2,6. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Medimos o nível de IL-6 em tecidos cerebrais utilizando um kit ELISA comercial (eBioscience, Thermo Fisher Scientific). Cada amostra foi testada de forma duplicada com diluições apropriadas para que as unidades luminescentes relativas pudessem estar dentro da gama linear das curvas padrão. O valor de IL-6 de cada amostra foi normalizado e expresso como um rácio em comparação com a proteína de carga total como um rácio relativo. A absorvância de cada amostra foi medida com um leitor de microplacas (Synergy Mx, BioTek, Winooski, VT).
2,7. Western Blot
Amostras de cérebro dissolvido foram processadas e executadas em géis SDS-PAGE. Foram então transferidas para membranas PVDF que foram depois bloqueadas com 5% de leite desnatado em tampão TBST. As membranas bloqueadas foram posteriormente investigadas com anticorpos para CD11b (1 : 4000; Abcam, UK), synaptophysin (SYP), p-Stat-3 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA), e total Stat-3 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA) em leite TBST durante a noite a 4°C. Após incubação com os anticorpos secundários durante 2 horas à temperatura ambiente respectivamente, as bandas de proteína na membrana foram reveladas com reacção de quimioluminescência. β-Actina foi utilizada como controlo interno (1 : 5000; Santa Cruz Biotecnologia, CA, EUA). Os resultados quantitativos foram expressos como uma proporção de cada proteína alvo para a sua β-actin.
2,8. Análise Estatística
Valores apresentados no estudo foram mostrados como a . O significado da diferença entre dois grupos foi determinado pela análise de Student -test. Um valor inferior a 0,05 foi considerado como estatisticamente significativo.
3. Resultados
3,1. Dose única de exposição a propofol causou comportamentos depressivos em ratos com suspensão da cauda e testes de natação forçada
P>Primeiro, testamos a hipótese se uma dose única de tratamento com propofol poderia causar efeitos a longo prazo no desempenho comportamental em ratos, concentrando-nos na forma depressiva. Utilizámos a suspensão da cauda e os testes de natação forçada nestes ratos para explorar os efeitos a longo prazo do propofol. No teste de suspensão da cauda, descobrimos que o propofol aumentou significativamente o tempo imóvel em comparação com os ratos de controlo sem tratamento com propofol quando os ratos eram pendurados na cauda (Figura 1). Para confirmar ainda mais os comportamentos depressivos nos ratos expostos ao propofol, utilizámos o método de natação forçada para medir o tempo de imobilização destes ratos. Os nossos resultados demonstraram que o propofol aumentou o tempo total do tempo imóvel em comparação com os ratos do grupo de controlo (Figura 2). Estes resultados acima revelaram que uma única dose de tratamento com propofol poderia causar e manter o desempenho comportamental depressivo a longo prazo em ratos.
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3.2. Dose única de Propofol – Comportamentos de Ansiedade Causados por Exposição em Ratos com Testes de Campo Aberto e Elevated Plus Maze Tests
Ansiedade é a maior complicação de coocorrência em depressão. Portanto, postulámos se o propofol poderia induzir comportamentos de ansiedade nestes ratos, baseando-nos nos resultados comportamentais acima referidos nestes ratos. Utilizámos o ensaio de campo aberto para testar o nível de ansiedade destes ratos. Como mostrado na Figura 3(a), o tratamento com propofol reduziu efectivamente o tempo total gasto pelos ratos na área central em campo aberto. E também medimos outro parâmetro importante do teste, a distância total do percurso dos ratos. Como esperávamos, a injecção de propofol reduziu significativamente a distância de viagem dos ratos na sessão de ensaio de 5 minutos em comparação com os ratos de controlo (Figura 3(b)). Em seguida, investigámos os comportamentos de ansiedade destes ratos em ensaios de labirintos mais elevados. Descobrimos que os ratos expostos ao propofol mostraram menos tempo significativo passado em braços abertos (Figura 4), o que estava de acordo com os resultados do teste de campo aberto.
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3.3. A dose única de exposição ao Propofol causou o aumento do nível de IL-6 no tecido cerebral dos ratos
Um estudo recente sugeriu o envolvimento de neuroinflamação nos défices cognitivos pós-operatórios do tipo delírio . Testamos se o propofol poderia ter impacto no nível de expressão de IL-6 nos tecidos cerebrais destes ratos. Para chegar à conclusão, realizámos o ensaio ELISA nos tecidos cerebrais (hipocampo e córtex) para avaliar o nível de IL-6 em ratos com ou sem tratamento com propofol. Os nossos resultados demonstraram que o tratamento com propofol nesta condição poderia ser capaz de upregular o nível de expressão desta citocina no cérebro de ratos expostos ao propofol (Figura 5). Este resultado indicou que o propofol poderia causar os comportamentos de ansiedade e depressivos em ratos, afectando a resposta inflamatória no seu cérebro.
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3.4. A dose única de exposição ao propofol causou a expressão reduzida de CD11b e a expressão aumentada de p-STAT-3 no tecido cerebral dos ratos
P>P>Pós, sondámos os possíveis mecanismos celulares e moleculares que podem ser responsáveis pelas mudanças de comportamento nestes ratos expostos ao propofol. Testamos se as células gliais eram influenciadas pelo tratamento com propofol, analisando a proteína microglial maker, CD11b. Com um estudo ocidental, descobrimos que o nível de expressão da CD11b foi reduzido no cérebro de ratos com tratamento com propofol (Figura 6(a)), o que sugeriu que a função microglial poderia ser regulada pelo tratamento com propofol. Entretanto, a expressão da proteína SYP pré-sináptica não foi afectada pelo tratamento com propofol (Figura 6(c)). Também estudámos a função do factor transcripcional STAT-3 investigando o estado de fosforilação do STAT-3 (p-STAT-3). Os nossos resultados ocidentais demonstraram que o tratamento com propofol causou o aumento do nível de expressão do p-STAT-3 sem afectar a expressão do STAT-3 total (Figura 6(b)). Estes resultados implicaram que o propofol poderia influenciar a função das células microgliais e melhorar a fosforilação do STAT-3 ao mesmo tempo que induzia os desempenhos comportamentais ansiosos e depressivos em ratos.
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4. Discussão
Disfunções cognitivas e de memória têm sido bastante estudadas, mas a flutuação de humor pós-operatória não tem atraído atenção suficiente até agora. Algumas evidências apoiaram a ideia de que houve mudanças de humor significativas que ocorreram nos pacientes expostos a cirurgia e tratamento anestésico. Aqui, testamos uma nova hipótese de que o tratamento anestésico per se pode ser suficiente para afectar significativamente o estado de humor em animais que foram submetidos à dose única de tratamento anestésico sem um procedimento cirúrgico de acompanhamento. Utilizámos propofol como o composto anestésico representativo e injectamo-lo intraperitonealmente nos ratos. Nos dias seguintes, foi realizada uma série de comportamentos depressivos e de ansiedade para observar as alterações de humor nos ratos. Verificámos que existiam diferenças significativas nos desempenhos comportamentais entre estes ratos com ou sem exposição ao propofol. Uma vez que estes efeitos induzidos pelo propofol foram mantidos durante um tempo significativo, enquanto mesmo depois de a medicação ter sido retirada, postulámos que estes efeitos não eram a influência anestésica aguda mas sim mediados por outros sistemas do SNC.
p>Neuroinflamação foi considerado um dos principais factores que contribuem para a depressão e outras mudanças de humor no SNC . Aqui, perguntamos se uma célula microglial foi activada no cérebro de ratos após a exposição ao propofol. O marcador de proteína da célula microglial, CD11b que é uma das proteínas marcadoras comuns para demonstrar a activação da microglia, foi investigado com o western blot. Surpreendentemente, os nossos resultados indicaram que o propofol poderia inibir o nível proteico de CD11b. A explicação plausível aqui é que o propofol poderia inibir a expressão da proteína CD11b, independentemente de as células microgliais terem ou não sido activadas. O avanço propofol pode ser importante para o tratamento potencial de aliviar a sobreactivação microglial em algumas condições patológicas do SNC, tais como trauma, AVC, e esclerose múltipla. Também analisámos o efeito do propofol nas proteínas sinápticas que são factores fundamentais muito importantes por detrás dos desempenhos comportamentais dos animais . Curiosamente, embora o propofol pudesse afectar a função da célula microglial, parecia não ter impacto no nível de expressão da proteína sináptica. Estas conclusões não estão de acordo com alguns relatórios anteriores . A razão possível pode ser devida à diferença de tempo quando as proteínas foram recolhidas após a administração do propofol. Mas os nossos resultados ainda sugerem que o propofol pode ter um impacto diferente sobre os neurónios e outras células gliais. No estudo futuro, os efeitos do propofol nas células glial e neuronais deveriam ser elaborados individualmente.
A resposta neuroinflamatória no SNC exposta à dose única de propofol foi validada pelo teste ELISA de IL-6 nestes dois grupos de ratos. Verificámos que o tratamento com propofol poderia induzir uma upregulação de IL-6 no cérebro do rato. Estas descobertas estavam de acordo com os resultados do propofol na função celular microglial. Embora inibindo o componente CD11b, o propofol pode activar as vias de sinalização relevantes que são importantes para a activação das células microgliais.
Collectivamente, o nosso estudo sugeriu que o propofol era capaz de influenciar a função das células microgliais e exacerbar a resposta inflamatória no SNC. A reacção celular e molecular pode ser responsável pelas mudanças de comportamento nestes ratos que são administrados com a dose única de propofol. O nosso estudo enfatizou o importante papel dos anestésicos no impacto das alterações de humor após a operação, mas o humor pode ser significativamente afectado por muitos factores, incluindo a inflamação que é muito frequentemente observada nos pacientes durante e após a cirurgia. Portanto, uma série de estudos sistémicos bem concebidos sobre um modelo animal que envolveu não só os anestésicos mas também o procedimento cirúrgico são justificados para o futuro.
Data Availability
Os dados utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante pedido.
Conflitos de interesse
Todos os autores declaram não ter conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro do Departamento de Ortopedia, Hospital Municipal de Qingdao, Qingdao, Shandong, China, e o apoio técnico da Universidade de Medicina de Weifang, Weifang, China.