Todas as faixas: anticorpo beta Actin – controlo de carga (ab8227) a 1/5000 de diluição
P>Pista 1: HeLa extracto de célula inteira
Pista 2: Extracto de células de levedura
Pista 3: Lisado de tecido cerebral do rato
- li>Ver a nossa lista de lisados de controlo positivo disponíveis, peptídeos bloqueadores, e proteínas de controlo positivo.
- Veja os anticorpos secundários AbExcel para bloqueios ocidentais excepcionais.
- Veja os nossos protocolos de vídeo fáceis de seguir.
Protocolos são fornecidos pela Abcam “AS-IS” baseados em experiências nos laboratórios da Abcam utilizando os reagentes e produtos da Abcam; os seus resultados da utilização de protocolos fora destas condições podem variar.
Transcrição Webinar
O objectivo da “western blotting” é a separação de proteínas num gel de acordo com o peso molecular. As proteínas são então transferidas para uma membrana onde podem ser detectadas usando anticorpos. Aquecer as amostras e 95 graus C durante cinco a 10 minutos num tampão de amostra contendo um agente redutor como o beta-mercaptoetanol. Isto resulta em proteínas linearizadas com uma carga negativa proporcional ao seu tamanho.
Colocar um gel no tanque de electroforese e adicionar em tampão, assegurando que os topos dos poços são cobertos. A percentagem de acrilamida do gel a ser utilizado depende do peso molecular da proteína alvo. Node um mercado de peso molecular na primeira faixa e depois carregue as amostras para os poços adjacentes. Todas as amostras que continham quantidades iguais de proteína. Uma vez carregadas todas as amostras, tampão publicitário, colocar a tampa sobre o tanque de electroforese. Ligar a fonte de alimentação e definir a voltagem recomendada pelo fabricante dos géis no tanque de gel. Deve ser possível ver bolhas a subir através do tanque. Fazer correr o gel até que a frente do coto se tenha movido suficientemente para baixo do gel.
A etapa seguinte é transferir as proteínas do gel para uma membrana. As membranas são geralmente feitas de nitrocelulose ou PVDF. Retirar o gel do tanque e libertá-lo cuidadosamente da sua caixa de plástico. Cortar os poços e o pé de gel e colocar o gel em tampão de transferência. Preparar a pilha de transferência fazendo sanduíche da membrana e do gel entre o papel filtro e as esponjas. A membrana deve ser rastreada até ao eléctrodo positivo e o gel mais próximo do eléctrodo negativo. Utilizar um pequeno rolo para remover quaisquer bolhas entre o gel e a membrana. Fechar a caixa de transferência e submergir num tanque de transferência contendo tampão de transferência. Adicionar água à câmara exterior para manter o sistema fresco e colocar a tampa. Ligar a fonte de alimentação para iniciar a transferência de proteínas. O tempo e a voltagem requerem optimização, por isso verifique as instruções do fabricante para orientação.
Agora que as proteínas tenham migrado do gel para a membrana de nitrocelulose, a proteína de interesse pode ser detectada como um anticorpo. A membrana pode ser removida do cassete e o mercado de peso molecular deve agora ser visível. Se necessário, a transferência de proteínas pode ser confirmada através da coloração da membrana com solução. Para evitar a ligação não específica do anticorpo, a membrana precisa de ser bloqueada. Verter tampão de bloqueio sobre a membrana e agitar suavemente sobre um balancim. Normalmente, isto é feito utilizando uma solução de 5% de leite ou albumina de soro bovino, BSA, durante duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus. O tempo e o tipo de tampão de bloqueio devem ser optimizados, por isso verifique a folha de dados do anticorpo primário que pretende utilizar para mais detalhes.
Após a membrana estar bloqueada, remova o tampão de bloqueio e adicione o anticorpo primário diluído na mesma solução. Incubar no balancim como anteriormente. Normalmente, as incubações de anticorpos primários são durante uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus C. A concentração de anticorpos e o tempo de incubação terão de ser optimizados. Consultar a ficha de anticorpos para orientação. Despejar o anticorpo primário e enxaguar a membrana duas vezes em tampão de lavagem. Seguir com uma lavagem de 15 minutos e três lavagens de 10 minutos num balancim. O tampão de lavagem é normalmente Trys tampão salino, TBS, ou fosfato tampão, salino, PBS, com 0,1% entre 20,
p>Derramar o tampão de lavagem e incubar a membrana na conjugação de anticorpos secundários que foram diluídos em tampão de bloqueio. Normalmente, isto é feito durante uma hora à temperatura ambiente, mas a concentração de anticorpos e o tempo de incubação terão de ser optimizados. Puxar o anticorpo secundário e lavar a membrana mostrou anteriormente.
Existem vários sistemas diferentes para a detecção. Se os anticorpos secundários se conjugarem numa enzima, incubar a membrana no substrato apropriado antes de se fazer a imagem. Se os anticorpos secundários forem counjugates fluorescentes, então pode passar directamente para a etapa de imagiologia. A imagiologia pode ser realizada com filme de raios X ou com um sistema de imagem digital. Colocar a membrana dentro de um tabuleiro de imagens. Colocar o tabuleiro de imagens num sistema de imagem. Os tempos de exposição terão muito provavelmente de ser optimizados a fim de detectar claramente as bandas relacionadas com as proteínas de interesse.