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Introduzione

Le malattie autoimmuni rappresentano un’ampia varietà di problemi clinici che colpiscono molteplici organi e sistemi, e colpiscono almeno il 5% della popolazione.1 Una grande diversità di anticorpi è stata associata a diverse manifestazioni cliniche e i clinici si sono basati su di essi per guidare la diagnosi clinica, le implicazioni prognostiche e in alcuni casi le decisioni terapeutiche.2,3 Le attuali conoscenze sulla patogenesi delle malattie autoimmuni concordano sul fatto che la loro comparsa è dovuta a una complessa interazione di geni e caratteristiche ambientali.4

La combinazione del test ENA in immunoblot (INNOLIA-ANA) e le tecniche di immunofluorescenza indiretta per rilevare gli anticorpi antinucleari in cellule HEp-2 come substrato sono buoni metodi di screening nei pazienti con un sospetto clinico di una malattia autoimmune, principalmente lupus eritematoso sistemico (SLE) e sindrome di Sjögren (SS). Anche se possono verificarsi risultati falsi positivi, i titoli > 1:80 suggeriscono la possibilità di una malattia autoimmune e dovrebbero indurre a ordinare valutazioni più specifiche per determinare le reattività specifiche degli anticorpi antinucleari (ANA) come gli anti-double stranded DNA e gli antigeni nucleari estraibili (ENA).5

Ro/SSA e La/SSB sono complessi antigenici eterogenei formati da tre diverse proteine (Ro-52, Ro-60 e La) e quattro particelle di YRNA. La proteina Ro60 agisce come un punto di controllo di qualità per l’RNA misfolded con chaperon molecolari per RNA difettosi. Gli RNA misfolded sono riconosciuti e poi etichettati da Ro60 per la degradazione. Ro52 interagisce con diverse molecole, tra cui la calreticulina e la proteina legante la catena pesante delle immunoglobuline. Si pensa che Ro52 modifichi il ruolo o la stabilità dei suoi substrati attraverso l’ubiquitinazione, e questa modifica potrebbe risultare negli eventi biologici mediati da Ro52.6

Gli anticorpi anti-Ro/SSA e anti-La/SSB sono stati descritti in varie malattie autoimmuni. Nella sindrome di Sjögren primaria (pSS) gli anticorpi circolanti sono rilevati in circa il 60-70% dei pazienti e livelli più alti sono stati associati all’insorgenza precoce della malattia e alle manifestazioni sistemiche.7,8 Il gruppo di studio GEMESS, che comprendeva 12 centri di riferimento in Spagna, ha confermato queste caratteristiche cliniche e di laboratorio in una coorte di pazienti con pSS e ha osservato livelli ridotti di C4 nei pazienti con insorgenza precoce della malattia.9

Gli anti-Ro/SSA sono rilevati nel 30% dei pazienti con diagnosi di LES, in particolare (90%) nei sottotipi a insorgenza tardiva, nel lupus eritematoso cutaneo subacuto, nel lupus indotto da farmaci e nei deficit congeniti di C2, C4 e C1q, anche nei pazienti con sindrome da sovrapposizione SS/SLE e malattia indifferenziata del tessuto connettivo.10 Al contrario, l’anti-La/SSB è più comunemente associato alla SS,11 e fortemente correlato in anti-La/SSB positivi con anti-Ro/SSA negativi alla disfunzione d’organo (rene, polmone, fegato).12

Dagli anni ottanta, lo sviluppo del blocco cardiaco congenito è stato descritto nelle malattie autoimmuni, come la SS e il LES. Tuttavia il coinvolgimento cardiaco è più legato agli anticorpi circolanti dalla madre piuttosto che alla diagnosi di malattia autoimmune. Sebbene il profilo immunitario sia variabile tra i diversi studi, l’anticorpo anti-Ro52 è più comune nelle madri di bambini con blocco cardiaco congenito, lupus neonatale e neonati con QT prolungato senza blocco cardiaco congenito.10,13,14

Prevalenza e associazioni cliniche degli anticorpi anti-Ro/SSA e anti-La/SSB possono variare nei diversi gruppi etnici. Oltre agli studi condotti nella popolazione spagnola sull’espressione immunitaria della SS, negli ultimi anni sono stati sviluppati altri studi sul profilo immunitario dei pazienti con anticorpi anti-Ro52, anti-Ro60 e anti-La. La maggior parte di essi sono stati eseguiti su diagnosi specifiche di disturbi del tessuto connettivo. In una coorte di pazienti con pSS sviluppata in Corea sono state osservate associazioni di questi anticorpi con diverse manifestazioni cliniche. L’anti-Ro52 era l’autoanticorpo più frequente e correlato a danni epatici e muscolari.15 Uno studio recente nella popolazione messicana per determinare la prevalenza di pSS nel LES di recente insorgenza ha mostrato la presenza di anti-Ro/SSA come predittore di sovrapposizione, mentre l’assenza di anti-Ro/SSA, anti-La/SSB e fattore reumatoide era correlata al minor rischio di sovrapposizione.16 Infine, il Ghent University Hospital ha proposto uno studio per determinare la distribuzione diagnostica associata al sierotipo di anti-Ro/SSA o anti-La/SSB in pazienti consecutivi inviati al laboratorio di reumatologia. Il LES era associato agli anti-Ro60 positivi e gli anti-La isolati predisponevano maggiormente alla pSS.17

Abbiamo intrapreso questo studio per valutare le associazioni cliniche, di laboratorio e di diagnosi di questo importante sottoinsieme di anticorpi in un ospedale in Spagna.

MetodiCentro di ricerca

L’ospedale di Jerez de la Frontera è un centro regionale specializzato situato nel sud-ovest della Spagna. Fornisce servizi clinici specializzati e ha 550 posti letto. Il suo dipartimento di immunologia analizza circa 5800 test ANA e 1700 test ENA immunoblot all’anno in una popolazione di 450.000 abitanti. Tra il suo personale di laboratorio ci sono un biologo e un immunologo che eseguono test specializzati per diversi dipartimenti. Qualsiasi clinico può ordinare test per gli anticorpi antinucleari, ma essi sono principalmente richiesti da reumatologi, seguiti da medici di base, gastroenterologi, internisti, nefrologi, pneumologi ed ematologi.

Campioni

Un registro computerizzato dei risultati di laboratorio è disponibile dal giugno 2002. Abbiamo analizzato retrospettivamente tutti i campioni consecutivi che hanno ordinato il test ANA da giugno 2002 a dicembre 2012. Sono stati considerati positivi i sieri con titolo di almeno 1:160 mediante test di immunofluorescenza su cellule HEp-2 (Euroimmun, Germania), eseguito da un singolo osservatore addestrato. I sieri con un test ANA positivo per questa diluizione di titolo sono stati analizzati utilizzando un test ENA in linea disponibile in commercio (INNO-LIA ANA, Fujirebio, Giappone). Questo kit fornisce un test qualitativo in vitro per gli autoanticorpi umani della classe IgG verso 13 diversi antigeni: RNP-70, RNP-A, RNP-C, Ro-52, Ro-60, La/SSB, Scl-70, CENP-B, istoni, Jo-1, Sm, proteina ribosomiale P e complesso U1-nRNP nel siero o plasma. La sensibilità e la specificità complessive della rilevazione degli autoanticorpi mediante LIA sono risultate simili o superiori rispetto alle tecniche convenzionali combinate.18,19 Questo immunoblot ha il 99,6% di specificità per l’anti-La, mentre l’anti-Ro60 ha il 98,2%, e l’anti-Ro52 ha il 98,3%.20

Inoltre il sistema informatico ci permette di rilevare nell’immunodosaggio anti-Ro e/o anti-La positivi con test ANA negativo, perché in pazienti con alto sospetto clinico di una malattia autoimmune il test immunoblot ENA è stato eseguito nonostante un test ANA negativo. Infine, solo i pazienti con più di un campione di siero positivo per anti-Ro/SSA o anti-La/SSB sono stati inclusi nello studio.

I dati clinici e di laboratorio sono stati ottenuti da due osservatori addestrati esaminando le cartelle cliniche o un database di laboratorio computerizzato.

Variabili

Le variabili indipendenti includevano dati demografici (età, sesso), clinici (diagnosi, caratteristiche della malattia), di laboratorio (emoglobina, conta dei leucociti e delle piastrine, livelli di ormone tiroideo) o immunologici (livelli di complemento, ipergammaglobulinemia, fattore reumatoide).

Analisi statistica

Sono state usate statistiche descrittive con frequenze e percentuali per variabili qualitative e media, deviazione standard e range per variabili quantitative. Le associazioni cliniche tra diversi insiemi di combinazioni positive contro le variabili cliniche o di laboratorio sono state analizzate mediante tabelle di contingenza utilizzando il test chi-quadrato o il test esatto di Fisher. In tutti i casi il livello alfa è stato fissato a 0,01 come aggiustamento per i confronti multipli. La forza dell’associazione è presentata come odds ratio e i suoi intervalli di confidenza al 99%. Abbiamo eseguito la cluster analysis delle variabili utilizzando il collegamento medio tra i gruppi e utilizzando come misura di intervallo la distanza euclidea quadrata. Le analisi sono state eseguite utilizzando SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Risultati

Un totale di 41.102 campioni di siero sono stati inviati al dipartimento di immunologia per la rilevazione degli ANA. 12.124 campioni sono risultati positivi da 2970 pazienti. Sono stati inclusi 322 pazienti con più di un campione di siero positivo per anticorpi anti-Ro52 e/o anti-Ro60 e/o anti-La con diluizione del titolo >160. Le femmine rappresentavano il 90,4% del campione. Avevano un’età compresa tra 10 e 84 anni, media 44,4 e deviazione standard 15,7 anni. Alcuni sieri isolati erano positivi al test immunoblot ENA con test ANA negativo. Ma i 322 pazienti hanno mostrato tutti o la maggior parte dei loro sieri positivi al test ANA, e il modello dei sieri per ogni paziente era praticamente identico. Nessun paziente è stato trovato nel nostro studio con più di un test negativo dei sieri per l’IIF.

I principali dati clinici e di laboratorio dei pazienti con campioni positivi per anti-Ro52 e/o anti-Ro60 e/o anti-La (322 casi) sono presentati nella tabella 1. Le specificità dei diversi antigeni di questi pazienti sono rappresentate nella tabella 2. Possiamo vedere che il risultato positivo più frequente è stato l’anti-Ro52 in 269 pazienti (83,5%), seguito da 205 pazienti con anti-Ro60 (63,7%) e 155 con anti-La (48,1%).

La tabella 3 mostra diverse associazioni tra combinazioni di anticorpi anti-Ro52/anti-Ro60/anti-La e diagnosi, risultati clinici o di laboratorio. La tabella 4 mostra associazioni significative di test positivi per la presenza di anticorpi circolanti anti-Ro52, anti-Ro60 e anti-La. Poiché è stato selezionato un livello di significatività rigoroso, alcune associazioni interessanti non sono state presentate come il gruppo anti-Ro52+ con pattern citoplasmatico (OR 3,72, 99% CI: 0,9-16, p value 0,04) e il gruppo anti-Ro60+ con lupus cutaneo subacuto (SCLE) (OR 7,0, 99% CI: 0,9-55,3, p: 0,023).

Usando la cluster analysis, si possono identificare quattro gruppi di autoanticorpi. Il cluster 1 comprende gli anticorpi contro SmB, SmD, RNP,70, RNP-A e RNP-C. Il cluster 2 si forma per gli anticorpi contro Scl-70, Ribosomal P, Jo1 e centromero. Il cluster 3 è formato per gli anticorpi contro Ro60 e SSB. Il cluster 4 si è formato per gli anticorpi contro Ro52 (Fig. 1).