Storia
La clonazione dei bovini è iniziata nel nostro laboratorio nel 1986 con l’introduzione di cellule donatrici embrionali in fase di clivaggio nucleare in ovociti enucleati in metafase II, con conseguente gravidanza e nascita di due vitelli sani (Prather et al., 1987). Il nostro successo e quello della Granada Genetics, quasi contemporaneamente, sono stati resi possibili da diversi fattori. Gli studi sugli anfibi hanno mostrato uno sviluppo più avanzato che si verifica dal trasferimento di nuclei in ovociti enucleati in metafase piuttosto che in zigoti pronucleati enucleati (Hoffner e DiBerardino, 1980). Prove da studi sul topo hanno dimostrato che la frequenza di sviluppo dopo il trasferimento nucleare (NT) era molto più alta quando i nuclei erano fusi in ovociti di topo piuttosto che microiniettati (McGrath e Solter, 1983). Gli studi di Willadsen (1986) nelle pecore hanno dimostrato che gli agnelli potevano essere prodotti mediante elettrofusione di cellule staminali embrionali in ovociti enucleati in metafase II. L’emergere di metodi per la produzione di embrioni in vitro e per la coltura di embrioni allo stadio di blastocisti ha anche facilitato l’avvento della clonazione del bestiame poiché gli embrioni bovini sono stati comunemente trasferiti nelle mucche allo stadio di blastocisti per produrre prole (First, 1990; Gordon, 1994; Fulka et al,
Le cellule staminali embrionali derivate dallo stadio di Cleavage fino allo stadio di morula furono usate per il trasferimento in ovociti enucleati in metafase in questi primi studi perché la prima letteratura sugli anfibi suggeriva che le cellule staminali embrionali erano totipotenti ma che le cellule differenziate somatiche o fetali non lo erano (DiBerardino, 1988; DiBerardino, 1997). Questo è stato confermato nei mammiferi da studi come quello di Navara et al. (1994). In questo studio, le cellule polarizzate e quelle impegnate nel lignaggio dei trofoblasti sono state usate come donatori nucleari e hanno prodotto pochissimi embrioni allo stadio di blastocisti (7%; n=158), mentre le cellule non polarizzate e non differenziate usate come donatori nucleari hanno prodotto un’alta frequenza di blastocisti (47%; n=184). In confronto, il 30% di 139 embrioni non selezionati si è sviluppato fino allo stadio di blastocisti. La conclusione negli anni ’80 che solo i tipi di cellule non differenziate erano efficaci dal punto di vista dello sviluppo come donatori nucleari era dovuta alla grande limitazione tecnica che i metodi artificiali non erano in grado di attivare gli ovociti così rapidamente ed efficacemente come lo erano gli spermatozoi (Ware et al., 1989). Questo costringeva all’uso di ovociti invecchiati, che avevano perso la capacità di riprogrammare un nucleo differenziato. Un confronto tra ovociti giovani e invecchiati è mostrato nella tabella 20.1 del primo laboratorio. Infatti, con molti dei primi protocolli il miglior successo si otteneva quando l’ovocita era così invecchiato che l’involucro nucleare della cellula donatrice e il suo contenuto erano conservati in toto senza rottura dell’involucro nucleare (Saeki et al., 1991; Leibfried-Rutledge et al., 1992; Poccia e Collas, 1997). Gli ovociti moderatamente invecchiati avrebbero permesso la rottura dell’involucro nucleare, ma avrebbero rapidamente riassemblato l’involucro nucleare ed escluso parte della cromatina dal nucleo.
Tabella 20.1. Uso di ovociti giovani rispetto a quelli invecchiati nel trasferimento nucleare
| Processo | 24 ore | 48 ore |
|---|---|---|
| Attivazione artificiale attivazione | Povero | Eccellente |
| Rottura e riassemblaggio dell’involucro nucleare | Sì | No |
| Sincronia del nucleo e dell’ovocita | Essenziale | Non essenziale |
| Riprogrammazione cellulare e genomica riprogrammazione della cellula donatrice | Sì | No |
| Sequenza e tempi di attivazione | Critico | Non critico |
| Cellule donatrici riuscite | Differenziate adulte o fetali | Totipotenti embrionali |
La capacità di attivare giovani ovociti bovini è stata ottenuta grazie allo sviluppo di procedure che sopprimevano in modo più completo e continuo l’attività del fattore promotore della metafase (MPF) e del fattore di promozione dellafattore di promozione della metafase (MPF) e del fattore citostatico (CSF), rispetto agli ionofori Ca2+ (Liu e Yang, 1999). Il MPF è valutato dall’attività della chinasi H1 e il CSF è valutato dall’attività della protein chinasi attivata da mitogeno (MAPK); insieme mantengono gli ovociti in metafase in arresto meiotico. Questa capacità di attivare gli ovociti giovani ha fornito la base per sfruttare la capacità degli ovociti in metafase II di riprogrammare le cellule donatrici nucleari fetali o somatiche in NT. Una di queste procedure è l’attivazione di giovani ovociti in metafase II con uno ionoforo di calcio, seguita da un’esposizione di 4-6 ore alla 6-dimetilaminopurina (6-DMAP) per interferire con la fosforilazione dei residui di serina e treonina su MPF e MAPK (Susko-Parrish et al., 1994). Un altro metodo usa il butirrolattone per lo stesso scopo (Motlik et al., 1998; Motlik et al., 2002). Uno studio sull’associazione di MPF, MAPK e dinamiche di progressione nucleare durante l’attivazione di ovociti bovini giovani e invecchiati ha suggerito che l’inattivazione di MPF e MAPK sono prerequisiti per il rilascio dall’arresto in metafase e la formazione di pronuclei negli ovociti bovini (Tian et al., 2003). Jang et al. (2005) hanno confrontato la competenza di sviluppo di embrioni di trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) ricostruiti con diverse cellule donatrici e hanno analizzato l’espressione genica nell’embrione risultante.
L’attivazione può anche essere ottenuta tramite inibizione della sintesi proteica con cicloeximide (CHX) dopo un trattamento con ionoforo, seguita da incubazione con citochalasina B (CB) per impedire l’estrusione della cromatina dalla cellula e mantenere così uno stato diploide (Liu e Yang, 1999). Bhak et al. (2006) hanno studiato il tasso di sviluppo e la ploidia degli embrioni prodotti da NT con diversi trattamenti di attivazione nei bovini. In questo studio, tre metodi per l’attivazione degli ovociti, cioè ionomicina da sola, ionomicina+DMAP, e ionomicina e CHX sono stati confrontati per lo sviluppo di embrioni prodotti da SCNT in partenociti e controparti IVF. I risultati suggeriscono che il trattamento DMAP dopo la ionomicina aumenta notevolmente i tassi di sviluppo dei partenociti, ma non differisce nello sviluppo delle blastocisti rispetto al trattamento CHX. Tuttavia, il trattamento DMAP ha aumentato il tasso di scissione in funzione del tempo per gli embrioni a due cellule. Inoltre, ha aumentato notevolmente l’incidenza delle anomalie cromosomiche nei partenoti e negli embrioni SCNT. Bhak et al. (2006) hanno concluso che il CHX combinato con la ionomicina è più desiderabile del DMAP per l’attivazione degli ovociti durante l’NT nei bovini. La deidroleucodina (DhL) è stata valutata come attivatore chimico degli ovociti bovini e degli embrioni ricostituiti SCNT (Bhak et al., 2006). Più recentemente, DhL è stato valutato come attivatore chimico di ovociti bovini ed embrioni ricostituiti SCNT (Canel et al., 2010). Gli ovociti sono stati attivati con basse ed alte dosi di ionomicina ed esposti a basse ed alte dosi di DhL da solo o, alternativamente, combinato con CB. I risultati hanno mostrato che DhL induce una dinamica di formazione pronucleare più simile a quella degli embrioni prodotti in FIVET rispetto al DMAP e che bassi livelli di DhL facilitano lo sviluppo delle blastocisti. Questi risultati indicano che un basso livello di DhL1 combinato con una lunga esposizione al protocollo CB potrebbe essere utile per i programmi SCNT (Canel et al, 2010).
Lo sviluppo di blastocisti dopo la fecondazione in vitro o NT è stato ulteriormente migliorato dalla scoperta che i primi ovociti che raggiungono la metafase II a circa 16 ore dopo la rimozione del follicolo, quando inseminati 8 ore dopo, producono una frequenza molto più alta di blastocisti rispetto agli embrioni ottenuti da ovociti maturati a 24 ore (Dominko e First, 1997). La capacità di produrre giovani ovociti altamente competenti che potevano essere attivati precocemente ci ha permesso di produrre blastocisti, gravidanze e prole dalla massa cellulare interna della blastocisti che era stata coltivata, moltiplicata e fatta passare per quattro o sei passaggi (First et al., 1994; Sims e First, 1994). L’efficienza non è stata elevata; circa il 15% delle NT ha prodotto blastocisti e quattro vitelli sono risultati da 34 trasferimenti di embrioni. La tipizzazione del DNA di questi vitelli ha confermato che la loro identità corrispondeva alle linee cellulari da cui erano derivati (First et al., 1994). L’efficienza dell’NT è stata maggiore quando sono stati usati blastomeri allo stadio di clivaggio o cellule di morula nel modello di ovocita invecchiato. Più recentemente, Kwun et al. (2003) hanno dimostrato che la cultura di embrioni prodotti in vitro o in NT si è sviluppata fino al normale stadio di blastocisti ad un tasso più elevato in presenza di una combinazione di fruttosio e glucosio. Questo gruppo ha concluso che il fruttosio potrebbe essere un substrato energetico più efficiente del glucosio per produrre un gran numero di blastocisti trasferibili derivate da SCNT (Kwun et al., 2003). Un’alternativa alla fusione del nucleo di una cellula in un ovocita enucleato, piuttosto che tramite microago o elettrofusione, è l’uso di virus fusogenici inattivati per inserire il nucleo della cellula nell’ovocita enucleato, come è stato presentato e rivisto da Rodríguez et al. (2008). Con questo metodo, un mezzo guscio di un ovocita enucleato ha un nucleo di donatore posto su di esso con un altro mezzo ovocita fuso sopra. Questo ha fatto sì che il 65,7% degli ovociti diventassero blastocisti quando il nucleo proveniva da una cellula somatica adulta e il 38,2% quando il nucleo donatore proveniva da una cellula fetale (Rodríguez et al,
Utilizzando cellule embrionali come donatori, il 20-50% dei trasferimenti nucleari ha prodotto blastocisti da trasferire nelle mucche, di cui circa il 50% diventa una gravidanza.
Dal 1993, centinaia di vitelli sono stati prodotti da NT utilizzando cellule embrionali come donatori nucleari. Ad oggi questo numero è cresciuto, ma non in modo esponenziale come ci si aspetterebbe. Il successo dell’NT richiede la completa cancellazione dell’imprinting genomico e dello stato di metilazione e una perfetta riprogrammazione del genoma della cellula donatrice. Il genoma riprogrammato deve mantenere la sua stabilità durante tutto lo sviluppo e infine risultare in una prole vitale con organi normalmente differenziati. La riclonazione è stata realizzata, e sono state usate cellule donatrici congelate, organi congelati senza crioprotettore, così come ovociti maturati in vitro (Stice e Keefer, 1993; Barnes et al., 1993). Nel migliore dei casi, il 20-50% delle NT ha prodotto blastocisti da trasferire nelle vacche, di cui circa il 50% diventa una gravidanza. Tuttavia, le perdite di gravidanza sono maggiori del normale, con ben il 20% che non riesce a partorire e richiede l’induzione del travaglio, con vitelli più grandi del normale spesso risultanti (Rodriguez-Osorio et al., 2009, 2012; Oback e Wells, 2007; Cibelli, 2007; Niemann et al., 2008; Kato et al., 1998; Oback 2009).
Le aziende commerciali hanno cercato di migliorare l’efficienza della clonazione embrionale a un livello e un costo adatti alla produzione commerciale del bestiame. Sfortunatamente, un livello sufficiente di efficienza non è stato raggiunto. Nel bestiame da latte, la produzione di cloni embrionali di bestiame ad alta produzione di latte richiedeva l’allevamento fino alla produzione di latte e poi la selezione di linee clonali embrionali ad alta produzione di latte. L’interesse commerciale nella clonazione embrionale è scomparso con l’avvento della clonazione da cellule germinali primordiali e linee di cellule somatiche fetali o adulte. Ci sono ancora tentativi di coltivare cellule staminali embrionali bovine in numero sufficiente per il trasferimento genico e la selezione di colonie transgeniche prima della NT (Mitalipova et al., 2001; Merton et al., 2003; Rodriguez-Martinez 2012). Più recentemente, le cellule staminali pluripotenti indotte sono state utilizzate in animali bovini modificati geneticamente e in applicazioni di allevamento transgenico (Cao et al., 2012; Han et al., 2011; Dong et al., 2007).